王開(kāi)麗，張石蕊

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

棉籽餅粕是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)原料，其含有蛋白質(zhì)約40%、賴(lài)氨酸1.59%和蛋氨酸0.52%，一直作為蛋白質(zhì)飼料用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，可在一定程度上替代豆粕等常規(guī)蛋白質(zhì)原料，彌補(bǔ)蛋白質(zhì)飼料資源的不足[1]。但是有毒物質(zhì)棉酚的存在限制了棉籽餅粕的大量使用。棉酚存在于棉籽色素腺體中，棉籽脫殼榨油后仍有部分棉酚殘留于棉籽粕中，若食用過(guò)量則會(huì)使動(dòng)物中毒，甚至造成死亡。棉酚按存在形式可分為游離棉酚（FGP）和結(jié)合棉酚（UGP）兩種，兩者之和稱(chēng)為總棉酚（TGP）。游離棉酚對(duì)動(dòng)物有毒，因?yàn)槠浜械幕钚曰鶊F(tuán)羥基和醛基未被封閉，而結(jié)合棉酚的活性基團(tuán)已與蛋白質(zhì)、磷脂、氨基酸等結(jié)合，對(duì)動(dòng)物沒(méi)有毒性[2]。鑒于棉籽餅粕中游離棉酚有害，國(guó)家制定了游離棉酚的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，于1992年4月作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)頒布實(shí)施。飼料中游離棉酚允許量見(jiàn)附表。

附表 游離棉酚的允許量（GB 13078—2001）mg·kg-1

目前采用的棉籽餅粕去毒的方法是在棉籽餅粕中按其游離棉酚的含量來(lái)決定加入FeSO4的用量。其比例規(guī)定為游離棉酚∶FeSO4=1∶1。因此檢測(cè)棉籽餅中游離棉酚的含量是合理利用棉籽餅的一個(gè)重要技術(shù)指標(biāo)。對(duì)游離棉酚的測(cè)定方法也多種多樣，目前已報(bào)道的游離棉酚檢測(cè)方法主要有比色法、紫外分光度法（UV）、高效液相色譜法（HPLC）和原子吸收分光光譜法（AAS）等，其中對(duì)飼料中游離棉酚的檢測(cè)以苯胺法和HPLC法使用最為普遍。

1 比色法

比色法有苯胺法、甲氧基苯胺法、三氯化銻（SbCl3）法、間苯三酚法等。目前中國(guó)普遍使用的方法是苯胺法。

1.1 苯胺法

國(guó)標(biāo)苯胺法是國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，測(cè)定棉籽餅粕及其配合飼料中的游離棉酚含量均可采用此方法。苯胺法又可分為國(guó)標(biāo)苯胺法（GB13086—91）、AOCS苯胺法（Ba7－58）（美國(guó)油化學(xué)家學(xué)會(huì)官方方法）和Smith苯胺比色法，這3種苯胺法分別以不同溶劑提取棉酚，用苯胺顯色后進(jìn)行比色測(cè)定。國(guó)標(biāo)苯胺法的測(cè)定原理是在3－氨基－1－丙醇存在下，用異丙醇與正己烷的混合溶劑（3∶2，V∶V）提取游離棉酚，加入苯胺與棉酚結(jié)合為苯胺棉酚，在最大吸收波長(zhǎng)440 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。測(cè)定之前先配制異丙醇與正己烷的混合溶劑（3∶2，V∶V）和溶劑A（取異丙醇500 mL、正己烷混合溶劑、3－氨基－l－丙醇2 mL、冰乙酸8 mL和水50 mL，放入1 000 mL容量瓶中，再用異丙醇、正己烷混合溶劑定容）。具體操作步驟參照GB/T13086—1991。

AOCS Ba7－58法是美國(guó)油化學(xué)家學(xué)會(huì)（AOCS）官方方法，AOCS明確定義為凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物統(tǒng)稱(chēng)為“游離棉酚”。該方法的原理是在適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)條件下，用70%丙酮水溶液提取棉酚，棉酚與苯胺作用可生成黃色的二苯胺棉酚，分別測(cè)定苯胺棉酚和棉酚的吸光度，兩者之間的關(guān)系見(jiàn)式1。

式中：F為換算因子，在波長(zhǎng)一定的條件下為常數(shù)；C為溶液中待測(cè)的游離棉酚的含量，單位mg；b、a分別為溶液中苯胺棉酚和棉酚的吸光度。

此式是根據(jù)朗伯－比爾定律A=￡bc推導(dǎo)而來(lái)。試驗(yàn)先利用棉酚標(biāo)樣（100%）配制一系列濃度的棉酚標(biāo)液，該標(biāo)液中游離棉酚的含量C是可計(jì)算得到，再通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)棉酚的b－a值，利用式（1）求得換算因子F的平均值，然后測(cè)定待測(cè)溶液的棉酚和苯胺棉酚的吸光度a、b，得到b－a值，再將數(shù)據(jù)代入式（1），從而得到待測(cè)溶液中棉酚的含量，此法即為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

Smith苯胺比色法的原理與苯胺法相同。提取液為溶液A（乙醇715 mL，用水稀釋至1 000 mL，加冰乙酸0.2 mL及乙醚200 mL）。

游離棉酚及其衍生物的結(jié)構(gòu)式中含有醛基和羥基，醛鄰位的酚羥基活性強(qiáng)，易與動(dòng)物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸、磷脂等反應(yīng)，造成動(dòng)物機(jī)體功能紊亂，產(chǎn)生毒性作用。對(duì)于棉籽餅粕飼料的安全檢測(cè)應(yīng)反映出樣品中有毒物質(zhì)的含量，所以檢測(cè)結(jié)果應(yīng)包含棉酚及其衍生物。而苯胺法對(duì)棉酚的檢測(cè)就是利用醛鄰位的酚羥基與苯胺發(fā)生反應(yīng)，生成的二苯胺棉酚在一定波長(zhǎng)處有最大吸收峰，利用分光光度計(jì)測(cè)吸收值得到校正吸光度A，代入計(jì)算公式即得游離棉酚含量。該方法的檢測(cè)結(jié)果就包含棉酚和含有活性酚羥基的棉酚衍生物。所以用苯胺法檢測(cè)飼料中的棉酚含量更合適，這種方法比較可靠，但是操作步驟繁瑣、耗時(shí)，不適合大批量樣品檢測(cè)，并且苯胺毒性大，操作中要特別小心，長(zhǎng)期接觸苯胺，很容易對(duì)操作人員造成傷害，苯胺不穩(wěn)定，易氧化由無(wú)色變?yōu)辄S色、棕色、直至紅棕色，從而使空白試驗(yàn)吸收值升高，需重新進(jìn)行蒸餾。周天兵等對(duì)AOCS苯胺法和國(guó)標(biāo)苯胺法對(duì)常規(guī)棉粕的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，AOCS苯胺法用丙酮70%的提取棉酚及其衍生物較充分，測(cè)定值重復(fù)間差異小，結(jié)果穩(wěn)定，而國(guó)標(biāo)苯胺法對(duì)棉酚及其衍生物的提取效果相對(duì)較差，結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性較差、建議可用AOCS苯胺法代替國(guó)標(biāo)苯胺法檢測(cè)飼料中游離棉酚含量[3]。

1.2 三氯化銻法

三氯化銻法的原理是在氯仿溶液環(huán)境下，游離棉酚與SbCl3反應(yīng)生成一種紅色絡(luò)合物，此絡(luò)合物在500～520 nm處有最大吸收峰，利用吸光度在一定范圍內(nèi)符合比爾定律進(jìn)行比色測(cè)定[4]。但因SbCl3遇水易生成渾濁沉淀，操作需嚴(yán)格細(xì)致，稍不注意就會(huì)使比色液渾濁，導(dǎo)致分析失敗，且靈敏度較差。此法對(duì)試樣中棉酚的含量也有所限制，當(dāng)樣品中的棉酚含量＞0.045%，會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3 間苯三酚法

間苯三酚法是利用樣液中的棉酚和間苯三酚在弱酸性溶液中（＞6 moL鹽酸溶液）生成有色絡(luò)合物，絡(luò)合物的最大吸收峰在550 nm，顏色深淺與含量成正比而進(jìn)行比色測(cè)定。該法簡(jiǎn)便、靈敏度高，分析速度高于苯胺法，是目前常用的快速分析方法。原間苯三酚法的溶劑抽提系統(tǒng)采用丁酮一水恒沸液加少量苯胺（90+10+0.5）的混合溶液，因苯胺與丁酮一水恒沸液互溶性很差，極不穩(wěn)定，易產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，造成提取液不穩(wěn)定，且制備恒沸溶液麻煩[5]。為克服這一缺陷，有學(xué)者改良了間苯三酚法，采用丙酮70%作為抽提液，同時(shí)縮短了抽提時(shí)間，靈敏度可達(dá)0.1 μg·25 mL－1（原方法的靈敏度為0.006 mg·25 mL－1），線性范圍0～160 μg·25 mL－1（原方法線性范圍是 0～100 μg·25 mL－1）。改良方法不僅克服了抽提液不穩(wěn)定的問(wèn)題，也進(jìn)一步提高了分析速度和檢測(cè)靈敏度，且線性范圍加寬。

2 紫外分光光度法

紫外分光光度法（UV）是食品行業(yè)檢測(cè)棉籽油中的游離棉酚含量的國(guó)標(biāo)法，也可用于測(cè)定飼料中的棉酚含量。該法用70%丙酮溶液提取樣品中的棉酚，提取液在378 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸收值與棉酚量在一定范圍內(nèi)成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較可得游離棉酚含量[6]。UV法所需儀器設(shè)備少、操作簡(jiǎn)單易行，但由于是直接測(cè)定樣品溶液的吸光度，沒(méi)有參比溶液作對(duì)照，使得樣品中存在的干擾物質(zhì)沒(méi)有被分離，因此，UV法得到的結(jié)果一般偏高[7]。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）的分離原理是當(dāng)液體流動(dòng)相所攜帶的混合物流過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)和固定相發(fā)生力的作用，混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異，因此，在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的停留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按不同次序從固定相中流出，達(dá)到分離效果。待分離物質(zhì)即使結(jié)構(gòu)非常相似，都具有不同的停留時(shí)間，只要選擇好合適的分離條件，就可以利用HPLC法將其成功分離出來(lái)，結(jié)構(gòu)類(lèi)似物之間不受干擾。HPLC法的理論價(jià)值是通過(guò)選用合適的分離條件分離出純棉酚，能比較真實(shí)地反應(yīng)樣品中的棉酚水平。但是由于棉酚分子結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)羥基和兩個(gè)醛基，性質(zhì)很不穩(wěn)定，很容易發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相似的棉酚類(lèi)似物。

目前關(guān)于HPLC法的報(bào)道較多，主要由于色譜柱、流動(dòng)相和萃取劑的選擇的不同使得操作方法以及測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性較差。張延坤等檢測(cè)結(jié)果表明，線性范圍為2～10 μg，最低檢出量為10 ng[8]。吳偉偉等試驗(yàn)結(jié)果表明，棉酚的最低檢出濃度為0.94 mg·kg－1，平均回收率為96.23%～99.36%，RSD為3.24%～4.02%[9]。

4 原子吸收光譜法

目前用原子吸收光譜法（AAS）測(cè)游離棉酚的報(bào)道很少，主要是沒(méi)有明確的空心陰極燈或無(wú)極放電燈做電源，無(wú)法實(shí)現(xiàn)AAS測(cè)定。董仕林等報(bào)道，以鎳元素?zé)魹楣庠从迷游諆x測(cè)棉籽油中的游離棉酚含量，用丙酮70%萃取試樣中的游離棉酚，以4 mA電流、0.15 mm狹縫等條件測(cè)定游離棉酚，試驗(yàn)結(jié)果與紫外分光光度法測(cè)得結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＜0.05）[10]。

5 小 結(jié)

測(cè)定棉酚含量有多種方法，各種方法的測(cè)定結(jié)果都能反映出樣品間棉酚的相對(duì)水平，研究者應(yīng)根據(jù)棉粕的加工用途和實(shí)際條件等具體情況選擇適合的分析方法。

[1]賀秀媛,李玉峰.棉籽餅粕飼料中游離棉酚測(cè)定方法的研究[J].中國(guó)畜牧雜志,2008,44（12）:60－62.

[2]張文舉.高效降解棉酚菌種的選育及棉籽餅粕生物發(fā)酵的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006.

[3]周天兵,宋代軍,李?lèi)?ài)科.兩種游離棉酚檢測(cè)方法對(duì)常規(guī)棉粕檢測(cè)的比較[J].畜牧與飼料科學(xué),2011,32（2）:14－16.

[4]葉世柏.化學(xué)性食品中毒與檢驗(yàn)[M].北京:北京大學(xué)出版社,1989.

[5]鄭清梅,溫茹淑,韓春艷.間苯三酚法快速測(cè)定棉粕中游離棉酚的方法研究[J].飼料工業(yè),2010,31（3）:42－44.

[6]黃永林,阮俊.棉籽中游離棉酚的含量測(cè)定[J].廣西植物,2001,21（4）:371－373.

[7]楊偉華,馮新愛(ài),戚廷香,等.幾種測(cè)定游離棉酚方法的比較[J].中國(guó)棉花,1995,22（2）:13－14.

[8]張延坤,房玉水,鄧峰,等.用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定棉籽蛋白中的游離和總棉酚[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),1995,17（4）:419－424.

[9]吳偉偉,許贛榮.HPLC法測(cè)定棉籽餅粕飼料中的游離棉酚[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32（5）:105－107,118.

[10]董仕林,洪加敏.應(yīng)用原子吸收法測(cè)定游離棉酚[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,1993,9（8）:366－367.