張 瑋， 燕繼曄， 郭 霞， 李興紅

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097）

葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體的制備與再生條件的優(yōu)化

張 瑋， 燕繼曄， 郭 霞， 李興紅＊

（北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097）

對葡萄潰瘍病菌菌絲搖培時間、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑種類及再生培養(yǎng)基類型進(jìn)行了探索和優(yōu)化，建立了葡萄潰瘍病菌穩(wěn)定、高效的原生質(zhì)體制備體系。以SR培養(yǎng)基作為再生培養(yǎng)基時，原生質(zhì)體再生率達(dá)到最高，為32.2%。該研究為建立葡萄潰瘍病菌高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，開展其致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。｀

葡萄潰瘍病菌； 原生質(zhì)體； 制備與再生條件

葡萄座腔菌科真菌葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeriaspp.）可侵染葡萄果實、枝干等部位，其所引起的葡萄潰瘍病可造成葡萄果梗干枯、果實干縮或掉粒、枝干潰瘍、樹勢減弱等癥狀，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植株整株死亡。截至目前，已發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌科的15種真菌能引起葡萄潰瘍病，在美國、墨西哥、法國、意大利、南非、智利等14個國家的葡萄產(chǎn)區(qū)均已發(fā)生，并造成了不同程度的損失。2009年，李興紅等在我國浙江省首次發(fā)現(xiàn)并報道了由病原菌Botryosphaeria dothidea引起的葡萄潰瘍?。?］，同年，燕繼曄和李興紅在湖南、湖北和浙江田間發(fā)現(xiàn)并鑒定了引起該病害的另一新種B.rhodina［2］。隨后，李興紅課題組又于2010年在山東省和河北省等地分離了葡萄潰瘍病的另一種病原菌B.obtusa［3］。目前，該病害嚴(yán)重影響了葡萄的食用價值和經(jīng)濟(jì)效益，成為阻礙葡萄產(chǎn)業(yè)健康、良性發(fā)展的重要威脅之一。

生產(chǎn)上對葡萄潰瘍病目前尚無有效的防治方法，對該病原菌的研究主要集中在生物學(xué)性狀方面，致病機(jī)理研究較少，因此，為了有效地防治該病害，需對其進(jìn)行分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的相關(guān)研究，鑒定一系列控制該病原菌致病性或致病力的基因，進(jìn)一步鑒定、研究基因的功能，從而對該病原菌致病機(jī)理有較為深入的了解。建立絲狀真菌高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法通常有兩種，一種是PEG（polyethylene glycol聚乙二醇）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，另外一種是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacteriumtumefaciens－mediated transformation，ATMT）［4－8］。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是最常用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化方法，其關(guān)鍵技術(shù)就是制備大量的、可再生的原生質(zhì)體［9］。目前，尚無關(guān)于葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeriaspp.）原生質(zhì)體制備和再生的相關(guān)報道。本研究首次優(yōu)化了葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體制備及再生條件，建立了適宜該病原菌的原生質(zhì)體制備及再生體系，將為下一步建立該病原菌的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

葡萄潰瘍病菌［Botryosphaeriarhodina（Berk.et Curt.）Arx］菌株JZB310113由本實驗室分離，純化并單孢分離保存于PDA斜面。

1.1.2 試劑

酸水解干酪素（casein acids hydrolysate）、酶水解干酪素（casein enzymatic hydrolysate）、崩潰酶（driselase）、蝸牛酶（snailase）購自美國Sigma公司；山梨醇（sorbitol）購自美國Amresco公司；酵母提取物（yeast extract）購自英國OXOID公司；瓊脂粉購自TaKaRa公司；NaCl、KCl、蔗糖等其他常規(guī)生化試劑均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g煮沸20～30min后，4層紗布過濾；2%葡萄糖；1.8%瓊脂粉；加水定容至1 000mL。CM液體培養(yǎng)基：0.6%酵母粉；0.3%酸水解干酪素；0.3%酶水解干酪素；1%蔗糖。STC：1.2mol／L 山梨醇，10mmol／L Tris－Cl（pH 8.0），50mmol／L CaCl2。SR 固 體 再生 培 養(yǎng)基：0.1%酵母提取物；0.1%酶水解干酪素；1mol／L蔗糖；0.7%瓊脂粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體產(chǎn)量計算方法：以1g菌絲裂解產(chǎn)生的原生質(zhì)體個數(shù)定義為原生質(zhì)體產(chǎn)量。用3層擦鏡紙過濾收集原生質(zhì)體，4℃2 000g離心15min，棄上清，5mL STC溶液重懸沉淀，4℃2 000g離心15min，棄上清后將沉淀溶于1mL STC溶液中，利用血球計數(shù)板計算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

（1）菌絲搖培時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

將葡萄潰瘍病菌JZB310113菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)36h，在菌落表面滴加2～3mL的無菌水，用涂菌環(huán)將菌絲打斷，接種到裝有150mL液體CM培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28℃120r／min振蕩培養(yǎng)20～32h，每隔4h收集菌絲進(jìn)行酶解，收集原生質(zhì)體，鏡檢統(tǒng)計原生質(zhì)體產(chǎn)量。

（2）酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

用滅菌的3層擦鏡紙過濾收集菌絲，收集到的菌絲用滲透壓穩(wěn)定劑沖洗后轉(zhuǎn)入50mL離心管中，按每克菌絲2mL酶液（崩潰酶和蝸牛酶的濃度均為20mg／mL）的比例加入細(xì)胞壁酶溶液，28℃120r／min恒溫振蕩2～6h，每小時鏡檢并計算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

（3）滲透壓穩(wěn)定劑種類及濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

在相同的酶解時間條件下，分別以0.7mol／L的KCl、NaCl、山梨醇、蔗糖4種溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑洗滌酶解產(chǎn)物，計算葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體產(chǎn)量。確定適合的滲透壓穩(wěn)定劑。

1.2.2 原生質(zhì)體再生

（1）培養(yǎng)基種類對原生質(zhì)體再生的影響

制備的原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋至1×104個／mL，各取0.1mL分別涂布在SR和PDA兩種再生培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)1～3d至平板表面長出小菌落為止。同時，取0.1mL原生質(zhì)體溶液，加入1mL無菌水，室溫靜置裂解30min后涂布到再生培養(yǎng)基平板作為對照，重復(fù)3次。計算原生質(zhì)體在上述兩種培養(yǎng)基上的再生率。

原生質(zhì)體再生率（%）＝

［（原生質(zhì)體再生的小菌落數(shù)量－對照小菌落數(shù)量）

／原生質(zhì)體數(shù)量］×100；

（2）酶解時間對原生質(zhì)體再生的影響

比較在不同酶解時間條件下，原生質(zhì)體在SR固體再生培養(yǎng)基上的再生率，確定適合葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體再生的最適酶解時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 菌絲搖培時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

結(jié)果表明，搖培時間為24h時，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最大，達(dá)到6.217×108個／mL（如圖1所示）。搖培24h的JZB310113菌株，生長旺盛，菌絲量比較多，且容易酶解，適合原生質(zhì)體的大量制備。搖培時間過短，產(chǎn)生的新菌絲量不足；搖培時間過長，菌絲體老化，細(xì)胞壁纖維素含量過高，不容易被崩潰酶崩潰，因此原生質(zhì)體的產(chǎn)量有所下降。

圖1 菌絲搖培時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.1.2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

結(jié)果如圖2，酶解開始后隨著時間的積累，原生質(zhì)體的產(chǎn)量增加，當(dāng)酶解時間為4h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大，為5.008×108個／mL，隨著酶解時間的繼續(xù)延長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量有所下降，可能是由于酶解時間過長，細(xì)胞壁酶對細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞造成的［10－11］。

圖2 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.1.3 滲透壓穩(wěn)定劑種類對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體穩(wěn)定形成的重要因素之一，能夠維持原生質(zhì)體內(nèi)外滲透壓平衡，防止原生質(zhì)體破裂，從而影響原生質(zhì)體產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量［12］。本研究選用4種不同的滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行原生質(zhì)體制備試驗。結(jié)果表明，采用NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，得到的原生質(zhì)體量最大，達(dá)到8.008×108個／mL（如圖3）。

2.1.4 滲透壓穩(wěn)定劑濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

滲透壓穩(wěn)定劑的工作濃度是原生質(zhì)體形成穩(wěn)定的另一重要因素，影響原生質(zhì)體產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量。試驗比較了不同濃度NaCl對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖4，以0.7mol／L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，可以獲得大量的適于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。這可能是因為0.7mol／L NaCl可以與葡萄潰瘍病菌細(xì)胞液形成等滲溶液，在內(nèi)外壓力一致的情況下，菌絲保持其生理狀態(tài)的穩(wěn)定，原生質(zhì)體可以順利而完整地釋放出來［13－14］。

圖3 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖4 NaCl濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.2 原生質(zhì)體的再生

收集原生質(zhì)體，用STC洗滌后，顯微鏡下觀察，可以看到呈圓球形的原生質(zhì)體，大小不一，直徑為4.97～19.49μm，平均大小為13.25μm（圖5）。

圖5 JZB310113原生質(zhì)體的形態(tài)

2.2.1 培養(yǎng)基種類對原生質(zhì)體再生的影響

葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體在SR和PDA培養(yǎng)基上的再生率分別為32.2%和19.8%，由此可見原生質(zhì)體在SR培養(yǎng)基上的再生率明顯高于在PDA培養(yǎng)基上的再生率，因此SR培養(yǎng)基為該菌適合的再生培養(yǎng)基。

2.2.2 酶解時間對原生質(zhì)體再生的影響

裂解酶對質(zhì)膜系統(tǒng)會有一定程度的破壞，因此酶解時間的長短也會嚴(yán)重影響原生質(zhì)體的再生［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在酶解時間2～4h時，原生質(zhì)體在SR上的再生情況基本一致，5h時出現(xiàn)明顯下降（圖6）。酶解時間為2h或3h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量較4h時低，綜合考慮以4h作為JZB310113菌株的最佳酶解時間。

圖6 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

通過對葡萄潰瘍病菌菌絲的搖培時間、細(xì)胞壁降解酶的工作濃度、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度及再生培養(yǎng)基等方面的研究，確定了葡萄潰瘍病菌原生質(zhì)體形成及再生的最適宜條件：將PDA平板上培養(yǎng)36h的葡萄潰瘍病菌菌絲接種到裝有100mL CM液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28℃120r／min培養(yǎng)24h，3層濾紙過濾收集菌絲，經(jīng)0.7mol／L的 NaCl充分滲透后，每克菌絲用2mL崩潰酶和蝸牛酶（濃度均為20mg／mL）的混合液酶解4h，酶解液在4℃條件下2 000r／min離心5min，調(diào)節(jié)至合適濃度后，涂布在再生培養(yǎng)基SR上。上述研究為葡萄潰瘍病菌穩(wěn)定、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及該病菌致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

適用于遺傳轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的制備，是建立植物病原真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)。據(jù)報道，原生質(zhì)體的形成與再生受多種因素的影響，包括菌株生長的培養(yǎng)基、菌齡、搖培時間、細(xì)胞壁降解酶的種類和濃度、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑及其濃度，還有菌株本身遺傳特性等多種因素的影響［15］。

由于絲狀真菌細(xì)胞壁的組成成分主要為幾丁質(zhì)，不同微生物細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量存在較大的差別，因此酶解不同微生物細(xì)胞壁所需要酶的種類也不同。為摸索葡萄潰瘍病破壁合適的酶，作者選用了崩潰酶、纖維素酶和蝸牛酶進(jìn)行酶解效果研究，結(jié)果表明，崩潰酶加蝸牛酶的效果最好（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）這可能是因為混合酶相互配合使用增加了脫壁效果［16］。

再生培養(yǎng)基的成分對原生質(zhì)體的再生影響顯著，特別是培養(yǎng)基中的碳源會影響微生物原生質(zhì)體的再生率。培養(yǎng)基中添加適量的某些營養(yǎng)因子可有效提高再生率，常用的有酵母膏、蛋白質(zhì)、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸鈉等。這些物質(zhì)可作為細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)，也可通過生理代謝或轉(zhuǎn)化成細(xì)胞壁的前體物質(zhì)或促進(jìn)代謝、加速細(xì)胞壁合成［17］，從而為細(xì)胞壁的再生提供材料保障。

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Development of a method for protoplast preparation and regeneration ofBotryosphaeriarhodina

Zhang Wei， Yan Jiye， Guo Xia， Li Xinghong
（InstituteofPlantandEnvironmentProtection，BeijingAcademyofAgricultureand ForestrySciences，Beijing100097，China）

The culture time of mycelium，the enzymolysis time，the type of osmotic stabilizer and the regeneration medium were optimized in this study.An efficient method for protoplast preparation and regeneration ofBotryosphaeriarhodinawas obtained.While SR medium was chosen as the regeneration medium，the regeneration rate of protoplast reached the highest，up to the maximum of 32.2%.This study provided powerful support for genetic transformation and transformant pathogenicity analysis inBotryosphaeriaspp.

Botryosphaeriaspp.； protoplast； preparation and regeneration

S 436.631；Q 813.11

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.005

2011－12－26

2012－02－18

國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－30）

＊ 通信作者010－51503434；E－mail：lxh1962＠yahoo.com.cn