藍(lán)國(guó)兵， 譚耀華， 何自福＊， 羅方芳， 梁麗歡， 虞 皓

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.高要市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 526100）

黃瓜褐斑?。–orynesporacassiicola）在廣東首次報(bào)道

藍(lán)國(guó)兵1，2， 譚耀華3， 何自福1，2＊， 羅方芳1， 梁麗歡3， 虞 皓1

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州 510640；2.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3.高要市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 526100）

2011年5月和8月，在廣東省高要市和增城市黃瓜主產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)黃瓜褐斑病，致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察和rDNA－ITS序列分析結(jié)果表明，引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌為多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）。本文是多主棒孢霉在廣東引起黃瓜褐斑病的首次報(bào)道。

黃瓜褐斑??； 多主棒孢霉； 病原鑒定

致 謝： 本實(shí)驗(yàn)室杜振國(guó)博士和湯亞飛助理研究員在分子鑒定方面給予了熱心指導(dǎo)，增城市果樹(shù)蔬菜研究所肖旭林農(nóng)藝師在標(biāo)本采集過(guò)程中給予了熱情幫助，特此致謝。

＊ 通信作者Tel：020－87597476；E－mail：hezf＠gdppri.com

多主棒孢霉（Corynesporacassiicola）侵染引起的褐斑病是黃瓜（CucumissativusLinn.）生產(chǎn)上重要病害之一。目前，該病已在我國(guó)遼寧［1－2］、河南［3］、河北［4］、山東［5］、寧夏［6］、甘肅［7］和上海［8］等省市的露地及保護(hù)地黃瓜上較普遍發(fā)生，并造成嚴(yán)重?fù)p失。除黃瓜外，該病原菌還能侵染茄子［9］、番茄［10］、苦瓜［11］、煙草［12］、橡膠［13］和木薯［14］等經(jīng)濟(jì)作物。多主棒孢霉主要侵染寄主植物的葉片，造成葉斑癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成落葉、落果等現(xiàn)象。

2011年5月，首次在廣東省高要市黃瓜產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似黃瓜褐斑病，生長(zhǎng)中后期的黃瓜植株受害最為嚴(yán)重，田間病株率20%～50%，甚至100%。同年8月，在廣東省增城市黃瓜產(chǎn)區(qū)也發(fā)現(xiàn)該病害，但零星發(fā)生，危害也較輕。為了弄清該病害的病原，進(jìn)而指導(dǎo)農(nóng)民科學(xué)防治，作者對(duì)發(fā)生在廣東的疑似黃瓜褐斑病的病原進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離和純化

2011年5月和8月，分別在廣東省高要市和增城市黃瓜產(chǎn)區(qū)采集疑似黃瓜褐斑病癥狀的病葉，采用植物病原真菌病組織常規(guī)分離法［15］進(jìn)行病原菌分離。分離的菌株單孢純化后，保存于PDA斜面上，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測(cè)定

選取高要和增城的代表性菌株各1株（編號(hào)分別為GY1和ZC1），分別接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)10d后用無(wú)菌水洗下分生孢子，并配成濃度為1×105個(gè)／mL的孢子懸浮液。用手持噴霧器將孢子懸浮液接種2片真葉期的黃瓜幼苗葉片（品種：‘豐研6號(hào)’，山西省夏縣良豐蔬菜研究所），以葉面布滿小水珠但不下滴為宜，接種清水作為空白對(duì)照。黑暗保濕培養(yǎng)24h后，置于28℃溫室中培養(yǎng)，接種4d后觀察發(fā)病情況，并對(duì)接種病葉組織進(jìn)行病原菌再分離。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次接種10株黃瓜苗。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將分離的病原菌株接于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5～15d，不定期觀察菌株的菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等特征，并測(cè)量分生孢子的大小，參照相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道［2，8－16］，鑒定病原菌。

1.3.2 病原菌rDNA－ITS序列分析

將代表菌株GY1和ZC1接于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)10d后，參考劉丹等報(bào)道的CTAB法［17］提取病原菌基因組DNA。以真菌通用引物ITS4和ITS5［18］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）包括 DNA 模板2μL（20～30ng），引物ITS4（10μmol／L）和ITS5（10μmol／L）各2μL，Premix Ex Taq? Version 2.0 25μL（TaKaRa公司），ddH2O 19μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性6min，94℃變性30s，55 ℃退火30s，72℃延伸50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。在1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)PCR結(jié)果，回收PCR產(chǎn)物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將所得ITS序列登錄到GenBank，并進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜病株田間癥狀

廣東省高要市蜆崗鎮(zhèn)露地栽培黃瓜（品種為‘豐研6號(hào)’，山西省夏縣良豐蔬菜研究所）病株癥狀表現(xiàn)為：葉片先出現(xiàn)水浸狀黃色小點(diǎn)，略凹陷，對(duì)光可見(jiàn)小點(diǎn)透明；病斑進(jìn)一步擴(kuò)展為近圓形，多數(shù)病斑受葉脈限制呈不規(guī)則形或多角形；后期病葉布滿黃色或黃褐色病斑，像一個(gè)“靶子”（圖1）。病株中下部葉片先發(fā)病，逐漸向上部葉片發(fā)展。田間有時(shí)與黃瓜霜霉病混合發(fā)生。

圖1 廣東黃瓜褐斑病田間癥狀

2.2 病原菌致病性測(cè)定結(jié)果

從高要市和增城市的黃瓜病葉中分別分離到6株和3株病原真菌，這些菌株菌落形態(tài)基本一致。從高要和增城分離的菌株中各選取1株作為代表菌株（編號(hào)分別為GY1和ZC1）進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果顯示，28℃噴霧接種4d后，2個(gè)菌株均可導(dǎo)致黃瓜葉片正面上出現(xiàn)水浸狀圓形黃色小病斑，葉片背部呈現(xiàn)灰白色小病斑（圖2）；后期病斑逐步擴(kuò)展，呈現(xiàn)圓形或多角形，與田間病葉癥狀相似，而清水接種的葉片沒(méi)有發(fā)病癥狀。從這些接種發(fā)病葉中重新分離到與接種菌株相同的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

在PDA平板上，菌落平展，灰色至淺棕色，培養(yǎng)基表面形成氈毛狀的菌絲層，后期菌株分泌黃褐色色素。分生孢子梗由菌絲衍化而來(lái)，無(wú)子座。分生孢子呈淺褐色，常單生，或2～5個(gè)串生于頂端，直立或稍彎，圓柱形或倒棍棒形，基部平截，頂部鈍圓，半透明至淺褐色，有2～8個(gè)假隔膜，大?。?5～150）μm×（4～9）μm（圖3）。各菌株的形態(tài)表現(xiàn)基本一致。這些特征與文獻(xiàn)［2，8－16］報(bào)道的黃瓜褐斑病菌基本一致，將引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌初步鑒定為多主棒孢霉（C.cassiicola）。

2.4 病原菌rDNA－ITS序列分析結(jié)果

應(yīng)用真菌18S－28SrDNA間隔區(qū)序列（ITS）的通用引物ITS4和ITS5，從菌株GY1和ZC1的DNA中分別PCR擴(kuò)增到580bp左右的特異片段。序列測(cè)定結(jié)果顯示，2個(gè)特異片段長(zhǎng)均為583bp，且兩者序列完全一致。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，菌株GY1（GenBank登錄號(hào)：JQ595296）、ZC1（GenBank登錄號(hào)：JQ595297）與C.cassiicola菌株（AY238606和AY238605）的ITS序列同源性為100%，與C.cassiicola其他菌株（JN54124、GU461298、GU138988、FJ85275）的序列同源性達(dá)99.8%（僅1個(gè)堿基差異）。該結(jié)果進(jìn)一步支持廣東黃瓜褐斑病的病原菌為多主棒孢霉（C.cassiicola）。

3 結(jié)論與討論

應(yīng)用常規(guī)的植物病原真菌研究方法，從廣東黃瓜褐斑病樣組織中成功分離獲得病原菌，形態(tài)學(xué)鑒定顯示，該病原菌為多主棒孢霉（C.cassiicola），rDNA－ITS序列分析進(jìn)一步支持該鑒定結(jié)果。因此，本研究將侵染引起廣東黃瓜褐斑病的病原菌鑒定為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗色菌科、棒孢屬（Corynespora）的多主棒孢霉（C.cassiicola）。

在國(guó)內(nèi)，由多主棒孢霉侵染引起的黃瓜葉斑癥狀的病害，不同研究者給以不同名稱，分別為黃瓜褐斑?。?－3，7，16］、黃瓜靶斑?。?，8］和黃瓜棒孢葉斑?。?］3種，但目前稱之為黃瓜褐斑病的占多數(shù)。因此，本研究中，我們也選用黃瓜褐斑病這個(gè)名稱。

早在上世紀(jì)五六十年代，我國(guó)已有多主棒孢霉侵染黃瓜的文獻(xiàn)報(bào)道［19］。上世紀(jì)90年代初，多主棒孢霉引起的黃瓜褐斑病在遼寧保護(hù)地大面積發(fā)生［1］。隨后的20年時(shí)間里，該病害不斷擴(kuò)展，危害也日趨嚴(yán)重，但主要集中在我國(guó)北部及西北部省份，且主要發(fā)生在設(shè)施栽培的黃瓜上［8］。在廣東黃瓜產(chǎn)區(qū)，一直未見(jiàn)多主棒孢霉侵染引起的黃瓜褐斑病發(fā)生與危害報(bào)道。因此，該病害是廣東黃瓜上發(fā)生的一種新病害。

鄒慶道等［2］的研究表明，黃瓜褐斑病菌（C.cassiicola）的菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28℃，產(chǎn)孢最適溫度為30℃；在有水滴條件下，孢子在15～35℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，說(shuō)明該病菌具有喜溫好濕的特點(diǎn)。廣東常年高溫、高濕，氣候條件十分利于該病的發(fā)生與流行，近期的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在粵西湛江和茂名部分黃瓜產(chǎn)區(qū)也發(fā)生了該病害（結(jié)果未顯示），這說(shuō)明該病害正在廣東省擴(kuò)展蔓延，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)與防治研究。

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First report ofCucumissativusbrown spot disease infected byCorynesporacassiicolain Guangdong Province

Lan Guobing1，2， Tan Yaohua3， He Zifu1，2， Luo Fangfang1， Liang Lihuan3， Yu Hao1
（1.ResearchInstituteofPlantProtection，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China；2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection，Guangzhou510640，China；3.GaoyaoAgriculturalTechnologyExtensionCenter，Guangdong526100，China）

Cucumber brown spot disease was observed in Gaoyao and Zengcheng of Guangdong Province in May and August，2011，respectively.The results of pathogenicity test，morphological observation and rDNA－ITS sequence comparison indicated that cucumber brown spot was caused byCorynesporacassiicolain Guangdong Province.This paper was the first report of the disease in Guangdong Province，China.

cucumber brown spot disease；Corynesporacassiicola； pathogen identification

S 436.21

B

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.043

2012－01－07

2012－02－03

國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2011DFB30040）；星火計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011GA780007）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009A020101001；2009B020201004；2010B050300014）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)