宋莎莎， 徐 進， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)中hcp基因的克隆及其功能研究

宋莎莎， 徐 進， 許景升， 陳匡宇， 張麗勍， 張 昊， 馮 潔＊

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥsecretion system，T6SS）是新近報道的細菌蛋白分泌系統(tǒng)?；谥参锴嗫菥虏×Ψ只關(guān)o82的全基因組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其大質(zhì)粒中存在T6SS的同源基因簇。本文通過基因敲除的方法構(gòu)建了Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)中的核心基因—hcp基因的缺失突變株，并比對了Po82野生型菌株、突變株及互補菌株在致病性、生長速率、運動性、生物膜形成等方面的變化。結(jié)果表明，hcp基因突變株較野生型菌株致病力顯著減弱，病程延長；在生長速率、運動性及生物膜形成方面，突變株較野生型無明顯差異。說明植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因參與了細菌的致病過程。

植物青枯菌； Po82菌株；hcp基因； 突變； 致病性

植物細菌性青枯?。╞acterial wilt of plants），是由茄科雷爾氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith）Yabuuchi et al.］［1］引起的一種世界性重大植物病害。青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染50多個科的450余種植物，包括許多單子葉植物和雙子葉植物，一年生植物以及喬木和灌木［2］。青枯菌不同菌株在寄主范圍、地理分布、致病性、流行學規(guī)律及生理生化特性方面均存在明顯差異，無疑是一個復雜的種。

根據(jù)青枯菌的寄主范圍可將其劃分為5個不同的生理小種（race）［3－4］，其中由青枯菌2號小種引起的香蕉細菌性枯萎病（moko disease）是香蕉生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一［5］。本實驗室前期對Po82菌株的致病性生測結(jié)果表明：Po82能夠侵染茄科植物的番茄、茄子及馬鈴薯，且兼具對香蕉的致病力，從而表明Po82致病進化地位極為獨特［6］。因此，對植物青枯菌Po82菌株的致病相關(guān)基因進行研究具有重要的理論意義。

病原細菌通常利用泌出蛋白來介導與寄主植物的相互作用［7］。革蘭氏陰性病原細菌可通過微小的裝置將蛋白運送到胞外或直接運輸?shù)郊闹骷毎?，這些微小裝置被稱為分泌系統(tǒng)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性病原菌中至少存在6種不同類型的分泌系統(tǒng)（Ⅰ～Ⅵ型分泌系統(tǒng)）。其中，Ⅵ型分泌系統(tǒng)是近期報道的一種細菌蛋白分泌系統(tǒng)。該系統(tǒng)在細菌中以基因簇形式存在，通常編碼12～25個蛋白，核心組分包括IcmF類蛋白、IcmH類蛋白、AAA＋ATP酶、ClpV、未知脂蛋白以及泌出蛋白VgrG和 Hcp［8－10］。

根據(jù)植物青枯菌Po82菌株的全基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)其大質(zhì)粒上存在Ⅵ型分泌系統(tǒng)（typeⅥsecretion system，T6SS）的同源基因簇。本研究采用同源重組雙交換法，構(gòu)建了Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)核心基因hcp的缺失突變株，并通過測定突變株致病性、運動性、生長速率和生物膜等相關(guān)基礎(chǔ)生物學特性的變化，以期評價該基因在植物青枯菌致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本試驗所使用的菌株、質(zhì)粒及引物序列見表1。青枯菌采用NA培養(yǎng)基，28℃條件下培養(yǎng)；大腸桿菌（Escherichiacoli）采用 LB［11］培養(yǎng)液，37℃下振蕩培養(yǎng)。抗生素使用濃度：氨芐青霉素（Amp）100μg／mL；慶大霉素（Gm）30μg／mL；卡那霉素（Kan）30μg／mL。10%蔗糖NA培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基附加蔗糖存儲液（50%蔗糖，115℃滅菌20min）至終濃度為10%。TZC培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基附加TZC存儲液（1%紅四氮唑，115℃滅菌7～8min）至終濃度50mg／L。

1.2 主要試劑

ExTaq酶、dNTP、EcoR Ⅰ、BamHⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、T4DNA Ligase、和pMD19－T載體選自大連寶生物（TaKaRa）公司，2×TaqPlatinum PCR Master Mix、DL15000、100bp、500bp DNA ladder購自天根公司，質(zhì)粒小提試劑盒、高純度質(zhì)粒大提試劑盒、大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根公司，氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan），慶大霉素（Gm），IPTG，X－gal購自Sigma公司，蔗糖為上海生工公司產(chǎn)品，引物為上海生工公司合成。

表1 本研究所用菌株、質(zhì)粒與引物的特性和來源1）

1.3 hcp基因缺失突變體的構(gòu)建

1.3.1hcp基因左右臂的PCR擴增

根據(jù)hcp基因核苷酸序列設(shè)計引物，擴增hcp基因上下游約500bp的片段作為該基因的左臂和右臂，用于構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒，將純化后hcp基因左臂和右臂的PCR擴增產(chǎn)物分別連接至pMD19－T載體上，命名為pMD19－h(huán)cpZ和pMD19－h(huán)cpY，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α后，酶切和測序鑒定。

1.3.2 慶大霉素基因的PCR擴增

根據(jù)質(zhì)粒載體pBBR1MCS－5（GenBank登錄號：U25061）中慶大霉素抗性基因的序列，設(shè)計引物擴增慶大霉素基因，慶大霉素基因gm長度為855bp，將純化后的慶大霉素基因PCR擴增產(chǎn)物連接至pMD19－T載體上，作為重組突變體篩選標記基因。

1.4 hcp基因重組自殺質(zhì)粒pK18－h(huán)cp－Gm的構(gòu)建及突變株的篩選

將hcp基因的左右臂及gm基因分別連接至自殺載體pK18mobsacB上，構(gòu)建自殺載體pK18－h(huán)cp－Gm。PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切參照文獻指南［14］，構(gòu)建過程見圖1。植物青枯菌Po82菌株感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化方法參照Ausubel等［15］和Lavie等［16］的方法并略有改動。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，28℃ 振蕩復蘇24h，然后依次進行如下三步篩選。（1）初篩：將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含慶大霉素的NA固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)24～48h，至單個菌落形成，提取基因組 DNA，用hcpZF／hcpYR引物擴增鑒定。（2）復篩：挑取上步的單菌落接種于NA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后梯度稀釋并涂布于含有10%蔗糖和慶大霉素的NA固體平板上，28℃培養(yǎng)24～48h，至單個菌落形成，篩選雙重組子。（3）第3次篩選：挑取上步的單菌落分別轉(zhuǎn)移至含有慶大霉素、卡那霉素和10%蔗糖平板上進行篩選。最終，篩選出同時具有卡那霉素敏感（Kans）、蔗糖抗性（Sucr）和慶大霉素抗性（Gmr）的菌落，提取基因組，以hcpZF／hcpYR引物擴增鑒定。最終得到的hcp基因突變株，命名為Po82△hcp。

圖1 重組質(zhì)粒pk18－h(huán)cp－Gm的構(gòu)建

1.5 Po82△hcp互補菌株的構(gòu)建

根據(jù)青枯菌Po82菌株hcp基因的ORF序列設(shè)計引物745orfF／745orfR（表1），將PCR 擴增得到504bp的ORF片段連接于pMD19－T上，構(gòu)建載體pMD19－h(huán)cpORF。將片段連至PML123載體，構(gòu)建載體PML123－h(huán)cpORF，之后電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入突變株P(guān)o82△hcp中，經(jīng)PCR、酶切及測序驗證正確后，通過NA＋Gm＋Kan平板篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR和測序驗證，將得到的互補菌株命名為Po82－h(huán)cpORF。最后，將互補載體PML123－h(huán)cpORF提取RNA做反轉(zhuǎn)錄，驗證其在pML123載體上能否表達。

1.6 致病性測定

Po82野生型菌株和突變株P(guān)o82△hcp于TZC平板培養(yǎng)48h后，挑取毒性單菌落于NA平板上畫線培養(yǎng)48h后，分別以蒸餾水配成3×107cfu／mL的菌懸液。參照He等［16］傷根接種法，接種番茄感病品種‘中蔬5號’。每菌株接種10株，重復3次。病情調(diào)查及統(tǒng)計方法參照Denny等［17］的方法。

1.7 運動性測定

制備3×108cfu／mL的細菌懸浮液，取5μL加到檢測細菌運動的半固體培養(yǎng)基SMM［19］平板上，培養(yǎng)皿非倒置30℃培養(yǎng)。運動性細菌朝周圍擴展形成一個明顯的圓形斑［19－22］。

1.8 生物膜形成能力測定

生物被膜的測定方法參照O’Toole等［23］方法。每個處理重復3次。在菌液與空氣交界處，細菌可以形成堅固的附著膜被結(jié)晶紫染色，呈現(xiàn)一個紫色環(huán)狀帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 hcp基因突變株P(guān)o82△hcp的PCR、酶切、測序驗證

首先，以植物青枯菌種特異性檢測引物759／760，檢測經(jīng)3步篩選獲得的菌株，均可擴增出大小約為280bp的條帶，確定是植物青枯菌（圖2）。其次，根據(jù)慶大霉素基因替換目的基因后PCR擴增后會產(chǎn)生片段差異，以745ZF／745YR引物分別擴增Po82野生型菌株和篩選到的突變株基因組DNA，PCR結(jié)果與之一致（圖3）。再次，用EcoR I和HindⅢ雙酶切載體pK18－h(huán)cp－Gm，經(jīng)電泳檢測與預(yù)期結(jié)果一致。最后，將篩選到的突變株進行PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果用DNAMAN進行比對，證實慶大基因替換了hcp基因，且hcp基因上下游序列未發(fā)生堿基突變，從而證明篩選到的菌株是植物青枯菌Po82菌株hcp基因的突變株。

2.2 hcp基因突變株P(guān)o82△hcp的互補菌株P(guān)o82－h(huán)cpORF的驗證

2.2.1 PCR、酶切、測序驗證

根據(jù)植物青枯菌Po82菌株hcp基因的引物745orfF／745orfR（表1），PCR擴增hcp基因的ORF序列，得到約504bp的片段與預(yù)期結(jié)果一致。然后經(jīng)過BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切得到504bp大小的片段。進一步測序，通過DNAMAN比對與目的片段一致。

2.2.2 反轉(zhuǎn)錄驗證

提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA進行PCR擴增，得到504bp大小的片段，證明其能夠在pML123載體上表達。

2.3 hcp基因突變對植物青枯菌Po82菌株表型特征的影響

2.3.1 平板運動性試驗

通過測量菌落直徑，比較植物青枯菌Po82野生型菌株和hcp基因缺失突變株在低濃度瓊脂平板（0.35%agar）上的運動能力，結(jié)果表明：突變株P(guān)o82△hcp較野生型菌株的運動性下降差異不顯著（p＜0.05）（圖4、圖5）。

2.3.2 菌膜形成試驗

3次重復試驗的結(jié)果表明：Po82野生型菌株和hcp基因突變株在菌膜的形成能力上無顯著性差異（圖6）。

圖6 Po82△hcp突變株的生物膜的A490測量

2.4 hcp基因突變對植物青枯菌Po82菌株致病性的影響

Po82野生型菌株在接種后第4天開始發(fā)病，hcp基因突變株在接種后第6天才出現(xiàn)明顯萎蔫癥狀；接種后第15天，Po82野生型菌株的病情指數(shù)達到3.33，hcp基因突變株僅為1.18，兩者差異顯著（p＜0.05）（圖7）。表明hcp基因與青枯菌的致病力相關(guān)。

圖7 hcp基因突變株致病力的測定

3 討論

2006年，科學家報道了在霍亂弧菌（Vibrio choleraePacini，1854）和銅綠假單胞菌 ［Pseudomonasaeruginosa（Schroeter）Migula］中存在一種新型分泌系統(tǒng)，并將其命名為Ⅵ型分泌系統(tǒng)［24－25］。在Ⅵ型分泌系統(tǒng)中通常存在一個基因簇，該基因簇通常編碼12～25個蛋白［26］。Hcp（hemolysin coregulated protein）蛋白和 VgrG （valine－glycine repeat protein G）蛋白是目前已知的由T6SS進行分泌的蛋白質(zhì)。尤其是Hcp蛋白，具有T6SS的細菌，在合適的條件下，均會泌出該蛋白。因此，Hcp蛋白已被作為一個鑒定T6SS功能的可靠指標。Hcp蛋白的晶體結(jié)構(gòu)也已研究清楚，其在細菌胞內(nèi)通常形成六聚體的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并通過層層疊加聚合成一個長100nm，直徑4nm的管道［27］。這種管狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成了T6SS的分泌通道，分泌因子藉此泌出至外部環(huán)境或宿主細胞內(nèi)。從而說明Hcp不僅是T6SS的分泌因子，而且參與T6SS的結(jié)構(gòu)形成。

本研究圍繞青枯菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)與致病性的關(guān)系，通過基因敲除的方法破壞了青枯菌T6SS基因簇中的的核心基因hcp。致病性接種試驗的結(jié)果顯示，突變體較野生型菌株發(fā)病晚，且發(fā)病程度相對減弱，但致病性并未完全喪失。隨后對與致病性密切相關(guān)的細菌運動性和生物膜形成，進行了相關(guān)試驗研究。鞭毛為細菌提供了運動能力，借助鞭毛的泳動能力，細菌可以獲得更多的營養(yǎng)和增殖空間，躲避有害因子，有利于其在外部環(huán)境中的生存［28］。相關(guān)研究已證實植物青枯病菌的運動性有助于其早期入侵寄主植物并定殖［29］；Shalom 等的結(jié)果表明，hcp基因可能與運動性相關(guān)。菌膜是細菌在有機體或非有機體表面形成的一種富含多聚糖成分的生物活性膜。菌膜的形成可以使細菌能夠在外界環(huán)境壓力較大的情況下生存。例如，在銅綠假單胞菌中，菌膜還與細菌的毒力相關(guān)［30］。試驗結(jié)果顯示突變株的菌膜形成較野生型略有增加但不明顯。綜上所述，試驗證實hcp基因突變株較野生型菌株致病力顯著減弱，病程延長；在生長速率、運動性及生物膜形成方面，突變株較野生型無明顯差異。植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因參與了細菌的致病過程。

本實驗室前期以青枯菌1號小種GMI1000菌株的Ⅵ型分泌系統(tǒng)核心基因vasK基因為研究對象，證明了突變株GMI1000－m的致病性較野生型GMI1000明顯下降，從而表明vasK基因在青枯菌致病過程中具有重要作用［31］?；趯嶒炇仪捌谘芯炕A(chǔ)，本研究針對青枯菌2號小種致病力分化菌株P(guān)o82的Ⅵ型分泌系統(tǒng)中的另一核心基因hcp基因進行了相關(guān)研究，并闡明了hcp基因參與了青枯菌的致病過程，并在其中起重要作用。

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Cloning and primary functional analysis ofhcpgene in T6SS cluster ofRalstoniasolanacearumPo82

Song Shasha， Xu Jin， Xu Jingsheng， Chen Kuangyu， Zhang Liqing， Zhang Hao， Feng Jie
（StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests，InstituteofPlantProtection，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

The bacterium T6SS（typeⅥsecretion system）is a novel protein secretion pathway reported recently.On basis of the complete genome sequence ofRalstoniasolanacearumstrain Po82，a26.8 kb T6SS gene cluster was found in megaplasmid of Po82 strain.In order to elucidate the function of the gene cluster of typeⅥsecretion system，thehcpgene deletion mutant was constructed by homologous recombination.The mutants were then compared with the wild－type strains in pathogenicity，the ability of growth，the mobility and biofilm formation.Pathogenicity tests showed that the disease symptom caused by mutants was delayed when compared with the wild－type strains，and the pathogenicity of the mutants were weaker than that of the wild－type strains.As for the ability of growth，the mobility and biofilm formation，there were no significant differences between the mutants and the wild－type strains.All of the results suggested that thehcpgene of the typeⅥsecretion system in Po82 was possibly involved in pathogenicity of the bacteria.

Ralstoniasolanacearum； Po82 strain；hcpgene； mutant； pathogenicity

Q 753

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.003

2011－12－02

2012－02－22

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”）項目（2009CB119200）；國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃（“863”）項目（2012AA101501）；國家自然科學基金項目（31101409，31272008）

＊ 通信作者E－mail：jfeng＠ippcaas.cn