祁 茹 溫建新 肖 宇 林英庭

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109）

目前，在微生物活菌計(jì)數(shù)和檢測(cè)中，常用方法有傾注平板法、平板涂布法、平板劃線法、濾膜法、MPN法和亨氏管法等。張銀旺（2005）[1]用平板涂布法培養(yǎng)雙歧桿菌計(jì)數(shù)，潘靈輝（2005）[2]和趙曉靜（2005）[3]等用平板涂布法培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌并計(jì)數(shù)。本文研究涂布、傾注和亨氏管法3種不同培養(yǎng)方式對(duì)厭氧微生物乳酸桿菌和雙歧桿菌檢出率的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

嶗山奶山羊新鮮糞便

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 乳酸桿菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基 MRS瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司，配方（g/L）：水解酪蛋白：10.0；大豆胨：5.0；酵母粉：2.0；葡萄糖：5.0；L-半胱氨酸：0.5；磷酸氫二鉀：2.0；氯化鎂：0.5；硫酸鋅：0.25；氯化鈣：0.15；氯化鐵：0.000001；瓊脂：20.0；吐溫80：1.0。pH值6.5 ± 0.1。

1.2.2 雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 TPY瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司，配方（g/L）蛋白胨：10.0；酵母浸粉：8.0；葡萄糖：4.0；磷酸氫二鉀：20.0；檸檬酸氫二銨：2.0；乙酸鈉：2.0；硫酸鎂：5.0；硫酸錳：0.04；瓊脂：14.0；吐溫80：1.0。pH值6.5 ± 0.2。

1.3 計(jì)數(shù)及鑒定

按照GB4789.2-2010和GB 4789.35-2010進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)方法

稀釋液的制備：稱取1 g新鮮糞便放入9 ml無菌生理鹽水中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。用移液器移取1∶10的樣品勻液1 ml，沿管壁緩慢注于盛有9 ml稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。依次類推，制備10倍系列稀釋樣品勻液[4]。

1.4.1 平板涂布法 預(yù)實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)適宜的稀釋度（每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)），同時(shí)作滅菌生理鹽水空白對(duì)照。每個(gè)稀釋度吸取0.1ml樣品勻液滴于預(yù)先傾注好的培養(yǎng)基表面中央位置，用無菌的L棒均勻涂布，室溫靜置5～10 min后將平板倒置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48h±2h后計(jì)數(shù)。

1.4.2 傾注平板法 預(yù)實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)適宜的稀釋度（每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)），同時(shí)作滅菌生理鹽水空白對(duì)照。每個(gè)稀釋度吸取0.1 ml樣品勻液對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其均勻分散，盡快向平皿中導(dǎo)入融化后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基約15 ml，再次轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48 h±2 h后計(jì)數(shù)。

1.4.3 亨氏管培養(yǎng)法 預(yù)實(shí)驗(yàn)選取3個(gè)適宜的稀釋度（每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù)），同時(shí)作滅菌生理鹽水空白對(duì)照。每個(gè)稀釋度吸取0.1 ml樣品勻液，加入裝有5 ml無菌無氧培養(yǎng)基（融化后冷卻至45℃左右）的亨氏管中，將其平放于盛有冰塊的盤中迅速滾動(dòng)，培養(yǎng)基環(huán)亨氏管內(nèi)壁凝固，置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48 h±2 h后計(jì)數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS17.0、One way ANOVA進(jìn)行方差分析和LSD 多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)微生物計(jì)數(shù)檢出的影響

表1 不同培養(yǎng)方式對(duì)乳酸桿菌和雙歧桿菌計(jì)數(shù)的影響（log10CFU/g鮮糞）

標(biāo)準(zhǔn)差是反應(yīng)數(shù)據(jù)離散程度、精密度的一種量化形式。由表1可知，與平板涂布法和傾注平板法相比，亨氏管法用于培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌對(duì)微生物計(jì)數(shù)的結(jié)果精確度好，再現(xiàn)性高。

2.2 不同培養(yǎng)方式對(duì)乳酸桿菌計(jì)數(shù)檢出的影響

乳酸桿菌在MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)特征：菌落黃白色，表面光滑，凸起，邊緣整齊，不透明，質(zhì)地軟，濕潤(rùn)，直徑0.6～2.7mm。

革蘭氏染色：陽(yáng)性。

涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈單、雙、短鏈或柵狀排列，無芽胞。

從表1可知，采用傾注平板法計(jì)數(shù)乳酸桿菌數(shù)（對(duì)數(shù)）為11.0405，P值為0.058，即樣本中變量關(guān)聯(lián)有5.8%的可能是由于偶然性造成的，此方法優(yōu)于平板涂布10.9798±0.099和亨氏管法的9.766±0.267。因此，乳酸桿菌適宜采用傾注平板法培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)雙歧桿菌計(jì)數(shù)檢出的影響

雙歧桿菌在TPY瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)特征：菌落表面光滑，凸起，邊緣整齊呈奶油色、瓷白色，質(zhì)地柔軟、細(xì)膩，不透明，直徑2.1～3.5 mm。

革蘭氏染色：陽(yáng)性。

涂片鏡檢：雙歧桿菌屬菌體形態(tài)具有多形性，有分支呈Y、V形或棒狀，標(biāo)本有醋酸氣味。

綜合分析表1中平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法檢測(cè)雙歧桿菌的均值、標(biāo)準(zhǔn)差、標(biāo)準(zhǔn)誤及P值，亨氏管法組均值大于平板涂布法組和傾注平板法組，且其標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤都遠(yuǎn)小于其他兩組，故筆者認(rèn)為在本試驗(yàn)條件下計(jì)數(shù)雙歧桿菌適宜用亨氏管法進(jìn)行。

3 討論

本試驗(yàn)涉及平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法，3種方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：

（1）平板涂布法：適用于需氧微生物的菌落觀察，菌落一般在培養(yǎng)基表面著生，培養(yǎng)基是固態(tài)的，但有時(shí)菌液分布不均勻，而且涂布棒上會(huì)帶走部分菌液，是計(jì)數(shù)結(jié)果小于真實(shí)結(jié)果，容易使結(jié)果產(chǎn)生負(fù)偏差。

（2）傾注平板法：適用于厭氧和兼性厭氧菌，不適合需氧和對(duì)熱敏感的細(xì)菌培養(yǎng)，菌落在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部都會(huì)生長(zhǎng)，培養(yǎng)基是液態(tài)的，操作相對(duì)麻煩。

（3）亨氏管培養(yǎng)法：適用于專性厭氧菌，不適合需氧和對(duì)熱敏感的細(xì)菌培養(yǎng)，菌落在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部都會(huì)生長(zhǎng)，不易染菌，培養(yǎng)基是液態(tài)的，操作相對(duì)簡(jiǎn)便。

乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于硬壁菌門（Firmicutes）桿菌綱（Bacilli）乳酸桿菌目（Lactobacillales）乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），能發(fā)酵葡萄糖（或利用碳水化合物）產(chǎn)生大量乳酸，屬兼性厭氧菌。采用涂布法培養(yǎng)乳酸桿菌會(huì)使或多或少的細(xì)菌受到空氣中氧氣的損傷而影響菌落的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，用亨氏管培養(yǎng)乳酸桿菌又會(huì)阻礙乳酸桿菌的有氧呼吸。本試驗(yàn)條件下用傾注平板法計(jì)數(shù)乳酸桿菌效果最優(yōu)。

雙歧桿菌是一類專性厭氧乳酸菌，但不同菌種對(duì)氧的敏感性有差異，某些菌種當(dāng)有CO2存在時(shí)，對(duì)氧可以耐受[5]。亨氏管中的培養(yǎng)基是無菌無氧的，菌落無論在培養(yǎng)基表面還是內(nèi)部，都能很好的生存和繁殖，有利于科學(xué)的計(jì)數(shù)雙歧桿菌，提高雙歧桿菌檢出率的正確性。

4 結(jié)論

（1）平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法用乳酸桿菌和雙歧桿菌檢出和計(jì)數(shù)無顯著差異。

（2）乳酸桿菌適宜用傾注平板法；雙歧桿菌適宜用亨氏管法。

[1]張銀旺. 糞便標(biāo)本中雙歧桿菌定量培養(yǎng)方法的建立與評(píng)價(jià)[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（6）：53-54

[2]潘靈輝. 低聚木糖對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸道菌群及免疫水平影響的研究[D].湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2005

[3]趙曉靜. 全營(yíng)養(yǎng)保健代乳粉及甘露寡糖對(duì)犢牛代謝及生長(zhǎng)發(fā)育研究究[D]. 河北：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005

[4]GB 4789.35-2010.國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-乳酸菌檢驗(yàn)[S]

[5]邵長(zhǎng)玲，孫寶清，魏秋芬,等. 雙歧桿菌的生理作用[J]. 中華醫(yī)藥雜志，2006，6（11）：1179-1181