李旭東 李桂玲 宋貫杰

實(shí)體腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于新生血管的生成，受血管生成刺激因子和抑制因子的雙重調(diào)節(jié)。內(nèi)皮抑素(Endostatin)是一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，能特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是衡量血管生成的定量指標(biāo)，但MVD與RCC預(yù)后是否相關(guān)，以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果并不一致［1～3］。本研究檢測(cè)RCC組織與癌旁組織Endostatin和MVD，并分析其與RCC病理類(lèi)型、分級(jí)、臨床分期之間的關(guān)系，以期為臨床評(píng)估RCC提供客觀預(yù)后指標(biāo)，并為RCC的抗血管治療提供研究依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇筆者所在醫(yī)院2009年1月～2010年9月手術(shù)切除腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本且臨床資料齊備者45例。男25例，女20例;年齡35～78歲，平均64.6歲。按WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，G1 15例，G2 20 例，G3 10 例。采用 Robson分期［4］，Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期11例，Ⅳ期8例。經(jīng)病理證實(shí)，透明細(xì)胞腎癌26例，嫌色細(xì)胞腎癌13例，嗜色細(xì)胞癌6例。另取腫瘤旁＞2 cm區(qū)域的正常腎組織35例作為正常對(duì)照組。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)手術(shù)時(shí)未作放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的生物治療;(2)行根治性手術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為腎細(xì)胞癌，組織學(xué)分類(lèi)明確;(3)術(shù)后石蠟標(biāo)本保存完好，有足夠待測(cè)組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Endostatin檢測(cè) 術(shù)后標(biāo)本分別取腫瘤組織和腫瘤旁正常腎組織，脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片，采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組標(biāo)本中Endostatin。Endostatin蛋白陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要存在于細(xì)胞漿(即腫瘤細(xì)胞胞漿棕染)。記分標(biāo)準(zhǔn)參照許良中等［5］的方法，隨機(jī)選根據(jù)細(xì)胞漿的著色程度及著色細(xì)胞的百分率進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2 MVD檢測(cè) 采用weidner法［6］，用 CD34抗體標(biāo)記微血管，計(jì)數(shù)腫瘤內(nèi)著色的毛細(xì)血管和微小血管。凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均計(jì)為1個(gè)血管，但肌層較厚及管腔面積＞8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下(×100)瀏覽全體，取密度較大的“熱點(diǎn)”處換高倍鏡(×400)計(jì)數(shù)，取6個(gè)不同的視野范圍，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以(±s)表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，多組均數(shù)間的比較應(yīng)用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性用雙變量相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Endostatin的表達(dá)情況 Endostatin蛋白在癌旁正常腎臟組織中的表達(dá)率為31.4%，在腎癌組織為77.8%，在腎癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁正常腎臟組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.78，P＜0.01)。見(jiàn)表1。Endostatin蛋白表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期中陽(yáng)性表達(dá)率高，與Ⅰ～Ⅱ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。腎細(xì)胞癌患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類(lèi)型及病理分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 Endostatin在不同腎臟組織中的表達(dá)(n，%)

2.2 MVD的表達(dá)情況 腎癌組織中MVD水平明顯高于癌旁正常腎臟組織，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.291，P＜0.01)。見(jiàn)表3。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期MVD顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.01)，臨床分期越早，MVD越低，臨床分期越晚，MVD越高;MVD在組織學(xué)G1、G2、G3級(jí)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，組織學(xué)分級(jí)低，腫瘤分化好，MVD越低;組織分級(jí)升高，分化差，MVD升高。腎細(xì)胞癌患者年齡、性別、腫瘤大小比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

2.3 Endostatin與MVD在腎癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Endostatin MVD在腎癌組織中表達(dá)的相互關(guān)系顯示，Endostatin與MVD的表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表3 MVD在不同腎臟組織中的表達(dá)

3 討論

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)為富含血管的實(shí)體性腫瘤，腫瘤血管生成是血管形成促進(jìn)因素和抑制因素之間失衡的結(jié)果，同時(shí)腫瘤血管生成也受進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的影響［7］。新生血管不僅可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，還能為腫瘤提供足夠的轉(zhuǎn)移路徑。一方面這些新生血管不成熟，結(jié)構(gòu)缺乏完整性，管壁薄弱，比正常血管更容易被腫瘤細(xì)胞穿透，使瘤細(xì)胞易穿透血管順血流到遠(yuǎn)隔部位形成微小轉(zhuǎn)移灶［8］;另一方面腫瘤組織內(nèi)基質(zhì)不完善，使瘤細(xì)胞產(chǎn)生的各種因子和蛋白酶類(lèi)滲漏至細(xì)胞間隙，進(jìn)而誘發(fā)更多的血管生成。MVD作為惡性腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估和分層治療的客觀指標(biāo)而被廣泛使用。本研究結(jié)果顯示，RCC組織中MVD明顯升高，且與病理分級(jí)和臨床分期相關(guān)。表明新生的微血管使瘤體血供增加，即微血管為腫瘤的快速增長(zhǎng)及代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

Endostatin基因定位于Collagen XⅧ基因第38～43號(hào)外顯子和部分37號(hào)外顯子編碼的C末端NC1結(jié)構(gòu)域內(nèi)［9］，在體內(nèi)由膠原XⅧ降解產(chǎn)生，能通過(guò)多種途徑抑制腫瘤血管的生成，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)。國(guó)內(nèi)外大量的文獻(xiàn)報(bào)道表明，Endostatin能夠有效控制非小細(xì)胞性肺癌、消化道腫瘤、腦膠質(zhì)瘤等各類(lèi)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［10～13］。本研究提示Endostatin蛋白在RCC組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常腎臟組織，Endostatin的表達(dá)強(qiáng)度在不同臨床分期的病例中，差異顯著。Endostatin在正常組織中有一定表達(dá)，提示Endostatin參與了正常情況下血管形成的生理調(diào)節(jié)過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，RCC組織中MVD與內(nèi)皮抑素呈高度相關(guān)，即隨著MVD增加，Endostatin表達(dá)增強(qiáng)。這可能是由于RCC細(xì)胞為了滿(mǎn)足其生長(zhǎng)和浸潤(rùn)的需要產(chǎn)生了大量促血管生成因子，機(jī)體內(nèi)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的Endostatin來(lái)抗衡機(jī)體內(nèi)高水平的血管生成因子，這是機(jī)體的自身調(diào)節(jié)機(jī)制，但是這種代償作用仍不能達(dá)到正常的平衡狀態(tài)，最終因?yàn)檎{(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致新生血管生成增多，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，測(cè)定 Endostatin、MVD可評(píng)估 RCC惡性程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。

表4 MVD在腎癌組織中表達(dá)與腎癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

表5 Endostatin與MVD在腎癌中表達(dá)的相互關(guān)系

［1］Sandlund J，Hedberg A．Evaluation of CD31(PECAM －1)expression using tissue microarray in patients with renal cell carcinoma［J］．Tumour Biol，2007，28:158 － 164．

［2］ Des Guetz G，Uzzan B，Nicolas P，et al．Microvessel density and VEGF exp－ression are prognostic factors in colorectal cancer:meta － analysis of the litera － ture［J］．Br J Cancer，2006，94:1823 －1832．

［3］Imao T，Egawa M，Takashima H，et al．Inverse correlation of microvessel density with metastasis and prognosis in renal cell carcinoma［J］．Int J Urol，2004，11:948 －953．

［4］ Robson CJ，Churchill BM，Anderson W．The results of radical nephrectomy for renal cell carcinoma［J］．J Urol，1969，101(3):297－301．

［5］許良中，楊文濤．免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)［J］．中國(guó)癌癥雜志，1996，6(4):229 －231．

［6］ Weidner N．Intratumor microvessel density as prognostic factor in cancer［J］．Am J Pathol，1995，147:9 － 19．

［7］ Shchors K，Evan G．Tumor angiogenesis:cause or consequence of cancer［J］．Cancer Res，2007，67:7059 －7061．

［8］ Claffey KP，Robinson GS．Regulation of VEGF/VPF expression in tumor cells:consequences for tumor growth and metastasis［J］．Cancer＆Metastasis Reviews，1996，15(2):165 －176．

［9］ Rehn M，Hintikka E，Pihlajaniemi T，et al．Characterization of the mouse gene for the alpha I chain of type XVⅢcollagen(Col 18a1)reveals that the three variant N－terminal polypeptide forms are transcribed from two widely separated Promoters［J］．Genomics，1996，32(3):436－446．

［10］吳春華．重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療治療晚期消化道惡性腫瘤療效觀察［J］．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(4):49 －50．

［11］Feldman AL，Alexander HR，Bartlett DL，et al．A prospective analysis of plasma Endostatin levels in colorectal cancer patients with liver metastases［J］．Annals of Surgical Oncology，2001，8(9):741 －745．

［12］Rocha FG，Chaves KC，Chammas R，et al．Endostatin gene theraphy enhances the efficacy of IL－2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice［J］．Cancer Immunol Immunother，2010，59(9):1357－1365．

［13］Xu CJ，Song JF，Su YX，et al．Expression of b － FGF and endostatin and their clinical signific in human osteosarcoma［J］．Orthop Surg，2010，2(4):291 －298．