李 鳳，黃冰玉＊，孫榮江，孫 波

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.東北師范大學(xué)人文學(xué)院體育教研部；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

Bcl-2在鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血早期的變化

李 鳳1，黃冰玉1＊，孫榮江2，孫 波3

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.東北師范大學(xué)人文學(xué)院體育教研部；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院）

目的 研究Bcl-2在鹽酸異丙腎上腺素（Isoprenaline hydrochloride，Iso）誘發(fā)大鼠心肌缺血早期的變化。方法注射鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血模型。采用常規(guī)染色，免疫組化染色及RT-PCR方法分析Bcl-2基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果Bcl-2mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：注射Iso后12h，Bcl-2mRNA表達(dá)增加；注射24h后，Bcl-2mRNA表達(dá)與較12h有所下降，但相對(duì)于正常對(duì)照組（P＜0.05）。Bcl-2蛋白表達(dá)隨病變程度的加重而降低。結(jié)論心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血的基礎(chǔ)，Bcl-2在早期（12-72h）便參與心肌缺血的全過(guò)程。

心肌缺血；細(xì)胞凋亡；Bcl-2

（ChinJLabDiagn，2012，16：1177）

心肌缺血（myocardial ischemia）是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧量減少，心肌能量代謝不正常，不能維持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)［1］。心臟供血不是一成不變的，而是始終帶有波動(dòng)，但這種波動(dòng)經(jīng)機(jī)體自身調(diào)節(jié)，促使血液供需相對(duì)恒定，保證心臟的正常工作［2］。如果任何一種原因引發(fā)心肌缺血，經(jīng)機(jī)體調(diào)節(jié)不能滿足心臟工作的需要，這就構(gòu)成了真正意義上的心肌缺血［3］。Bcl-2蛋白是一種細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)可抑制細(xì)胞凋亡［4］。本實(shí)驗(yàn)從基因和蛋白水平進(jìn)行研究，旨在探討注射Iso后，Bcl-2在大鼠心肌缺血早期的變化。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸異丙腎上腺素注射液（由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，Iso）；羊抗大鼠Bcl-2單克隆抗體（由博士德公司提供）；SP-9000免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（由北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司提供）；MD-100自動(dòng)生化分析儀（MD公司）；徠卡4215切片機(jī)（上海永傲精密儀器有限公司）；Olympus PM-10AO全自動(dòng)顯微照相裝置（廣州市得銳豐光電有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Wistar清潔級(jí)大鼠20只，體重180-220g（由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。分為正常對(duì)照組和Iso組（包括12h，24h和72h組），每組5只。模型組大鼠皮下多點(diǎn)多次注射2mg／kg Iso；正常組注射同體積的生理鹽水進(jìn)行刺激。

1.3 HE組織化學(xué)染色

嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 Bcl-2蛋白組織化學(xué)染色

按免疫組化檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠心肌組織陽(yáng)性信號(hào)的吸光度（A）。

1.5 半定量 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2mRNA表達(dá)

取新鮮凍存心臟組織，按Trizol試劑盒提供方法提取。引物：根據(jù)文獻(xiàn)及Genbank提供RNA序列確定RT-PCR所用引物。Bcl-2上游GAPDH內(nèi)參基因上游引物5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下 游 引 物 5’-TCC ACCACCCTG TTG CTG TA-3’；Bcl-2：上 游 引 物 5’-GGGATACTGGAGATGAAGACT-3’，下 游 引 物 5′－CCACCGAACTCAAAGAAGG-3’。94℃變性，退火溫度55℃，循環(huán)數(shù)35，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為452 bp和367bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下拍照，用凝膠成像處理系統(tǒng)對(duì)每一樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行灰度掃描，以GAPDH光密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，Bcl-2表達(dá)量以Bcl-2與GAPDH吸光度（A）之比來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Bcl-2的表達(dá)量用±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組心肌排列整齊，橫紋清晰，胞核明顯，無(wú)細(xì)胞腫脹。注射Iso 12h后，出現(xiàn)界限清晰、多發(fā)散在壞死灶。72h后，較12h更為明顯，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 心肌組織HE染色結(jié)果（×400）

2.2 Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Bcl-2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組中可見(jiàn)呈淺黃色或棕褐色陽(yáng)性物質(zhì)，定位于胞漿中；胞膜也有少量的陽(yáng)性表達(dá)。注射72h后，Bcl-2陽(yáng)性逐漸降低（P＜0.05），具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 心肌組織免疫組化染色結(jié)果 （×400）

2.3 Bcl-2mRNA表達(dá)情況

RT-PCR 結(jié) 果 顯 示，注 射Iso 12h 后，Bcl-2 mRNA表達(dá)增高趨勢(shì)明顯，且Bcl-2mRNA表達(dá)在12h達(dá)高峰（P＜0.01），24h有所下降但仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05），72h后逐漸得到恢復(fù)。見(jiàn)表1及圖3。

3 討論

細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在于多種有MF的心臟疾病中，細(xì)胞凋亡參與其中［5］。在原發(fā)性高血壓中，RAAS系統(tǒng)的激活以及容量和壓力負(fù)荷的增加均可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)細(xì)胞凋亡，MF與凋亡細(xì)胞顯著增多系系相關(guān)［6］；Hong等［7］用免疫組化方法和掃描電鏡研究擴(kuò)張型心肌病心肌標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞減少與炎癥和細(xì)胞壞死無(wú)關(guān)，認(rèn)為心肌細(xì)胞以及心肌間質(zhì)細(xì)胞的凋亡可能是主要原因；同時(shí)超氧化物可以刺激心臟成纖維細(xì)胞增生和TGF-β1表達(dá)增多，通過(guò)這兩方面作用超氧化物可致MF［8］。

表1 心肌組織中Bcl-2的基因和蛋白表達(dá)

圖3 心肌組織中Bcl-2的基因表達(dá)

Bcl-2屬于跨膜蛋白，主要分布于核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，Bcl-2高表達(dá)的細(xì)胞能耐受多種細(xì)胞毒性因子的殺傷作用。因此在眾多凋亡相關(guān)基因中Bcl-2是目前最受關(guān)注的基因之一；后來(lái)人們通過(guò)免疫組化，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)等方法充分證明了Bcl-2的抑制凋亡作用［9］。

本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)多次皮下注射2mg／kg Iso誘發(fā)大鼠心肌缺血模型。HE染色結(jié)果顯示：在注射Iso 12h后出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，隨時(shí)間的延長(zhǎng)缺血壞死面積明顯增加。這些結(jié)果提示：注射2mg／kg Iso可成功地誘發(fā)大鼠心肌缺血性壞死。為探討B(tài)cl-2在鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血早期的變化，本文實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)及RT-PCR方法，對(duì)缺血性心肌壞死所致MF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Bcl-2蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行早期觀察，結(jié)果表明：多點(diǎn)多次皮下注射Iso誘發(fā)大鼠心肌缺血性壞死后，Bcl-2mRNA在12h達(dá)到高峰（P＜0.01），72 h后隨有所降低，但仍未恢復(fù)到正常水平（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)逐漸降低，提示心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血的基礎(chǔ)，Bcl-2在早期（12-72h）便參與心肌缺血的全過(guò)程。

［1］Li C，Gao Y，Xing Y，et al.Fucoidan，a sulfated polysaccharide from brown algae，against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats via regulating the inflammation response［J］.Food and Chemical Toxicology，2011May 27.［Epub ahead of print］.

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［3］曲相如.人參皂苷Re對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制［D］.吉林：吉林大學(xué)，2008.

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The early change of Bcl-2In the Iso-induced myocardial ischemia in rats

LIFeng，HUANGBing－yu，SUNRongjiang，etal.（TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China）

ObjectiveTo investigate the early change in the Iso-induced myocardial ischemia in rats.MethodsRat myocardial ischemia models were induced by isoproterenol（Iso）injection.Conventional staining，immunohistochemical staining and RT-PCR were used to analyze expression of Bcl-2gene and protein.ResultsBcl-2mRNA arrived peak at 12h（P＜0.05）.Bcl-2protein expression with the severity of disease decreases in 12-72h.ConclusionMyocardial apoptosis is an important reason of Iso-induced myocardial ischemia，Bcl-2had a hand in the whole process in the early myocardial ischemia.

Myocardial Ischemia，apoptosis，Bcl-2

R540.41

A

1007－4287（2012）07－1177－03

＊通訊作者

2011－12－08）