趙麗紅，趙立勤，于艷華，石 卓

（1.白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 白城 137000；2.大安市中醫(yī)院，吉林 大安 131300；3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，吉林 長春 130021）

清開靈注射液對心肌缺血－再灌注損傷大鼠凋亡相關(guān)蛋白Caspase表達的影響

趙麗紅1，趙立勤2，于艷華1，石 卓3＊

（1.白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000；2.大安市中醫(yī)院，吉林 大安 131300；3.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，吉林 長春 130021）

目的 探討清開靈注射液（QKL）對心肌缺血—再灌注損傷后大鼠心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase表達的影響及其作用機制。方法實驗共設(shè)假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參注射液組（DS組）及清開靈注射液組（QKL治療組），每組8只，各組術(shù)前連續(xù)舌下靜脈給藥1周，采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支40min后，松解再灌注120min，制備心肌缺血—再灌注模型，實驗結(jié)束后HE染色觀察心肌細胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組化觀察心肌Caspase-3、Caspase-9表達情況。結(jié)果QKL能夠下調(diào)心肌細胞Caspase-3、Caspase-9表達，從而減少心肌細胞的凋亡。結(jié)論QKL對大鼠心肌缺血－再灌注損傷具有保護作用，其保護作用的機制與下調(diào)心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9表達有關(guān)。

清開靈注射液；心肌缺血－再灌注損傷；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

（ChinJLabDiagn，2012，16：1171）

目前的研究表明，心肌缺血－再灌注損傷過程中不但存在細胞壞死，同時亦存在細胞凋亡。心肌細胞壞死一旦啟動，則難以控制，但細胞凋亡是受一系列程序調(diào)控的過程。因此，調(diào)控心肌細胞凋亡成為抑制心肌細胞壞死的重要措施。caspases是細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，主要作用為破壞細胞骨架，因此若能抑制其活性，細胞凋亡過程勢必受阻［1］。本研究旨在觀察清開靈注射液對caspases表達的影響，初步探討清開靈注射液在心肌缺血－再灌注損傷過程中的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器Wistar大鼠，雌雄兼用，清潔級，體重250±30g，合格證號：SCXK-（吉）2003-0001，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。清開靈（QKL）注射液（北京中藥廠生產(chǎn)）。丹參（DS）注射液。Caspase-3、Caspase-9免疫組化檢測試劑盒（北京中杉生物有限公司生產(chǎn)）。

1.2 動物模型制作本研究的動物模型制備在經(jīng)典缺血再灌注模型［2］基礎(chǔ)上進行了改良：在20%烏拉坦麻醉下，仰臥位固定，頸部正中分離氣管行氣管插管，開胸后接呼吸機。小動物呼吸機設(shè)定潮氣量為09、呼吸頻率為66－76次／min，吸呼比為1∶2，根據(jù)呼吸頻率及深度調(diào)整呼吸參數(shù)。自左胸3－4肋間開胸，暴露心臟，以肺動脈圓錐與左心耳之間的左冠狀靜脈為標(biāo)志，找出左冠狀動脈前降支主干。除假手術(shù)組外，其余各組均以0號線立即結(jié)扎冠脈，打活結(jié)，形成心肌缺血后將心臟送回胸腔。結(jié)扎冠狀動脈40min后，打開活結(jié)放松絲線再灌注120 min，形成缺血－再灌注模型。實驗中以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高為冠狀動脈結(jié)扎成功的標(biāo)志，變化不明顯者、穿線中大量出血者剔除實驗。

1.3 實驗分組及給藥各組術(shù)前連續(xù)舌下靜脈給藥1周，第七天術(shù)前15min舌下靜脈給藥。后每只大鼠開胸，暴露心臟，穿線，15min后取心電圖正常者隨機分組。每組8只，分為4組，即假手術(shù)對照組、模型組、復(fù)方丹參注射液組（陽性對照藥DS組）及清開靈注射液組（QKL治療組）。假手術(shù)對照組：冠狀動脈下穿線不結(jié)扎；模型組：結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以心電圖ST段明顯抬高。丹參注射液組：舌下靜脈給藥20mg／kg，15min后結(jié)扎左冠狀動脈前降支。清開靈注射液組：舌下靜脈給藥20mg／kg，15min后結(jié)扎左冠狀動脈前降支。缺血40min后，打開結(jié)扎線形成再灌120min。S-T抬高，說明模型成功。

1.4 觀察心肌組織形態(tài)學(xué)的變化每組隨機取3只鼠的心尖部分作組化標(biāo)本置于10%的中性甲醛中室溫固定72小時后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切取數(shù)個4μm厚的切片，分別作蘇木精－伊紅染色（HE染色），觀察清開靈注射液對缺血－再灌注損傷大鼠心肌組織的病理組織學(xué)變化。

1.5 免疫組化法檢測心肌細胞凋亡每標(biāo)本測定5張切片，每張切片6個視野以視野數(shù)為單位，每組共30個視野，用HAIPS-1000高清晰彩色病理圖像測量系統(tǒng)進行測量，選取OD值（平均光密度）為半定量參數(shù)，測定Caspase-3和 Caspase-9蛋白的表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析和q檢驗，百分數(shù)采用χ2檢驗。以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清開靈注射液對Caspase-3的影響凋亡的心肌細胞核呈現(xiàn)為黃色，棕黃色或棕褐色，主要是心肌細胞，少數(shù)為浸潤的淋巴細胞和血管內(nèi)皮細胞。與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-3表達明顯增加；與模型組比較，DS組及QKL組Caspase-3表達明顯減少，且QKL組與DS組比較，無明顯差異。由此可見QKL可能通過下調(diào)心肌缺血再灌注損傷大鼠Caspase-3的表達，進而減少心肌細胞的凋亡，見圖1。

圖1 清開靈注射液對Caspase-3表達的影響

2.2 清開靈注射液對Caspase-9的影響凋亡的細胞核仍呈現(xiàn)為黃色，棕黃色或棕褐色。與假手術(shù)組比較，模型組Caspase-9表達明顯增加；與模型組比較，DS組及QKL組Caspase-9表達明顯減少，且QKL組與DS組比較，無明顯差異。由此可見QKL可能通過下調(diào)心肌缺血再灌注損傷大鼠Caspase-9的表達，進而減少心肌細胞的凋亡，見圖2。

2.3 清開靈注射液對心肌損傷組織形態(tài)學(xué)的影響HE染色見對照組（圖3A）心肌纖維排列整齊，可見分支，偶見閏盤，細胞核位于肌纖維中央，心肌間質(zhì)和心肌未見異常。缺血－再灌注組（圖3B）可見較大范圍的心肌間質(zhì)水腫灶，心肌間質(zhì)間隙擴大。在間質(zhì)水腫灶內(nèi)可見較多心肌纖維胞漿嗜伊紅濃染，胞核濃縮，少數(shù)心肌纖維出現(xiàn)溶解、破壞，但局部浸潤炎細胞較少，表明模型建立成功。清開靈注射液組（圖3D）可見到心肌間質(zhì)水腫灶，但其范圍較缺血－再灌注組明顯縮小。在間質(zhì)水腫灶內(nèi)可見少數(shù)肌纖維胞漿嗜伊紅濃染，胞核濃縮，但未見明顯肌纖維溶解破壞。少數(shù)肌束可見波浪狀纖維。模型組（圖3B）見內(nèi)層心肌呈灶狀肌纖維間水腫及嗜伊紅濃染，病變重于清開靈注射液組。

圖2 清開靈注射液對Caspase-9表達的影響

圖3 清開靈注射液對缺血－再灌注心肌損傷組織形態(tài)學(xué)的影響

3 討論

目前已經(jīng)表明丹參對心肌缺血－再灌注損傷具有保護作用［3］，故本實驗將丹參注射液作為陽性對照藥，更直接的表明清開靈注射液的作用。研究表明，Caspases是細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是介導(dǎo)細胞凋亡的核心蛋白酶［4，5］。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，激活的Caspase-3可以裂解多種底物，包括抑制凋亡的蛋白、Caspases酶原、細胞外基質(zhì)蛋白及骨架蛋白、DNA修復(fù)相關(guān)分子、與mRNA剪切有關(guān)的因子和DNA片段形成因子等，這些底物參于凋亡過程中細胞核、細胞骨架或胞膜結(jié)構(gòu)蛋白的降解，從而導(dǎo)致細胞凋亡［6］；細胞發(fā)生凋亡時，Caspase自我活化并相互激活。而Caspase-9，接受到信號后，能通過被酶催化或自剪接而激活，然后引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，Caspase-9在級聯(lián)反應(yīng)的上游，活化的 Caspase－9進一步激活其下游的Caspase-3，使細胞凋亡 。

在人類細胞中，Caspases的超表達和激活不僅直接破壞細胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細胞凋亡，而且通過滅活Bcl-2等凋亡抑制物和產(chǎn)生促細胞凋亡的片段而誘導(dǎo)細胞凋亡［7］。研究還表明：Caspases通過裂解核酸內(nèi)切酶的抑制物而引起DNA片斷化（fragmenta2tion），說明Caspases蛋白酶家族是引起細胞凋亡的關(guān)鍵分子群，其中Caspase-3是凋亡信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵效應(yīng)酶，起細胞凋亡執(zhí)行器的作用［7］。本研究結(jié)果顯示缺血再灌注早期大鼠心肌中有細胞凋亡參與心肌損傷，缺血40min再灌注120 min后心肌細胞組織切片觀察到 Caspase-3、Caspase-9陽性表達的細胞明顯增多，應(yīng)用QKL干預(yù)后心肌細胞Caspase-3、Caspase-9陽性表達明顯減少，表明QKL能夠抑制心肌細胞凋亡的發(fā)生，從而在心肌缺血再灌注損傷中起保護作用。這可能是其對大鼠心肌缺血－再灌注損傷具有保護作用的機制。

［1］金惠銘，主編.病理生理學(xué)［M］.第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：139-143.

［2］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1014.

［3］季海剛，司 亮.丹參對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.臨床醫(yī)藥實踐，2006，15（2）：52.

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［6］Tamatani M，Mitsuda N，Matsuzaki H，et al.A pathway of neuronal apoptosis induced by hypoxia／reoxygenation：roles of nuclear factor-kappaB and Bcl-2［J］.J Neurochem，2000，75（2）：683.

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Effects of Qingkailing Injection on apoptosis related protein expression of caspase in myocardial ischemia-reperfusion injur- ty rats

ZHAOLi-hong，ZHAOLi-qin，YUYan-Hua，etal.（BaichengMedicalCollege，JilinProvince，Baicheng137000，China）

ObjectiveTo explore the effects of Qingkailing（QKL）on apoptosis in myocardia of rats after ischemicreperfusion.MethodsRats were divided into sham，model，DanShen and Qingkailing groups at random，8rats in each，and were treated with medicines by sublingual vein administration respectively last 1week.All rats were subjected to openning chest then the left anterior desending coronary arteries（LAD）were ligated for 40min and unclamped for 120 min，at the end of，myocardial pathological changes were observed by light microscope after HE dyeing，and measure the apoptotic cells by TUNEL to observe the expressiones of caspase-3and caspase-9by immunohistochemistry.ResultsQKL downregulated the expressiones of Caspase-3，Caspase-9.ConclusionQKL have protective effects on ischemiareperfusion in rats，which may be related to downregulated the expressiones of Caspase-3，Caspase-9during ischemiareperfusion.

Qingkailing myocardial ischemic and reperfusion apoptosis Caspase-3Caspase-9

R541.4

A

1007－4287（2012）07－1171－03

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字【2008】第439號）

＊通訊作者

趙麗紅（1970-），女，講師，主要從事心血管藥理學(xué)教學(xué)及研究。

2011－08－07）