張漢超，馬 波

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)附屬天津市第四中心醫(yī)院 胃腸外科，天津 300140）

Vpr抑制人大腸癌細(xì)胞株HT-29增殖及調(diào)節(jié)存活素表達(dá)的研究

張漢超1，馬 波2＊

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學(xué)附屬天津市第四中心醫(yī)院 胃腸外科，天津 300140）

目的 觀察I型人類免疫缺陷病毒蛋白R(shí)（Viral protein R、Vpr）在體外對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29增殖抑制及探索Vpr對(duì)HT-29細(xì)胞存活素（Survivin）表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將Vpr基因以不同感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染至HT-29細(xì)胞。MTT法檢測(cè)Vpr對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡變化。逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡（western blot）法檢測(cè)mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)Vpr蛋白的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組大腸癌細(xì)胞HT-29增殖受到抑制（MOI＝200），從轉(zhuǎn)染72h開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組MTT值與對(duì)照組及空載體組比較差異均具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制逐漸增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染72h后（MOI＝200），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組及空載體組比較均差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組處于G2／M期細(xì)胞比例與對(duì)照組及空載體組比較均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染72h后，實(shí)驗(yàn)組（MOI＝50）Survivin基因的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組及空載體組（MOI＝200）比較均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并且survivin的表達(dá)隨著MOI的增加而減弱。結(jié)論Vpr體外可以誘導(dǎo)細(xì)胞HT-29G2／M期阻滯及凋亡從而有效抑制細(xì)胞HT-29增殖，其機(jī)制可能與Vpr下調(diào)Survivin基因的表達(dá)有關(guān)。Vpr在大腸癌的治療中具有潛在的應(yīng)用前景。

HIV-1；病毒蛋白R(shí)；大腸癌；細(xì)胞周期G2停滯；細(xì)胞凋亡；存活素

（ChinJLabDiagn，2012，16：1157）

HIV-1Vpr是HIV-1病毒的非結(jié)構(gòu)性基因之一，它編碼的病毒蛋白（Viral protein R、Vpr）分子量為14kD，由96個(gè)氨基酸構(gòu)成。研究顯示其具有良好的抗腫瘤前景［1，2］。本實(shí)驗(yàn)將Vpr基因轉(zhuǎn)染至人大腸癌細(xì)胞HT-29內(nèi)，探索Vpr對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29增殖抑制及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑Vpr基因序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Ad–Vpr由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，滴度達(dá)到5×108PFU／ml［3］；MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Western blot所用抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）及含青霉素100 U·mL－1、鏈霉素100mg·L－1的RPMI-l640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中，培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃潮濕環(huán)境。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別在無(wú)血清培養(yǎng)基條件以轉(zhuǎn)染Ad-Vpr，并以轉(zhuǎn)染 Adv作為模擬感染組，以加入等量RPMI-l640培養(yǎng)基作為對(duì)照組（Control），轉(zhuǎn)染8h后，PBS沖洗兩次，更換為常規(guī)培養(yǎng)基。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）比色法測(cè)Vpr對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶-EDT A消化并計(jì)數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔5×103個(gè)。24 h后，分別以MOI為200轉(zhuǎn)染Adv，Ad-Vpr或者加入等量RPMI-1640。每組3個(gè)復(fù)孔。1，2，3，4，5天后，加入20μl MTT（5mg／ml）置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄去液體每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩15min，570nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，記錄結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)Vpr對(duì)細(xì)胞HT-29細(xì)胞周期及凋亡的影響HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，Adv-vpr、Adv（MOI＝100）分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞，按DNA周期試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期分布及處于亞二倍體的細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比例。

1.5 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染Adv-Vpr（MOI＝50、100、200），Adv（MOI＝200）72h后分別收集細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量為30μg每孔，積層膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1h后，加入一抗（1∶1 000）4℃搖床過(guò)夜，TBST洗膜10min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10min×2次及TBS洗膜10min×1后，ECL法顯色，Alpha Innotech凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果。

1.6 RT-PCR檢測(cè) Survivin mRNA 表達(dá)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)值對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，Adv-Vpr（MOI＝50、100、200），Adv（MOI＝200）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol提取總mRNA，每份標(biāo)本重復(fù)測(cè)3次，以β-actin為內(nèi)參，Survivin及β-actin的引物序列為：Survivin 上 游 引 物 5’-GAGGAAACTGCGAAGAAAGTG-3’，下 游 引 物 5’-GGTG-GCACCAGGGAATAAA-3’，β-actin上游引物 5’-CCTCGCCTTTGCCGATC-3’，下 游 引 物 5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB（溴化乙錠）染色。Survivin和β-actin條帶灰度比值作為survivin mRNA的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，n＝3，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vpr對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響Vpr組與Control組吸光度值從第三日開(kāi)始與Control組或Adv組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Vpr對(duì)細(xì)胞HT-29生長(zhǎng)抑制率（（1-Vpr組吸光度值／Control組吸光度值）×100%）隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)而增加，Adv組無(wú)顯著生長(zhǎng)抑制，Adv組與Control組吸光度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 Vpr抑制細(xì)胞HT-29體外增殖

2.2 免疫印跡證實(shí)Vpr效果轉(zhuǎn)染72h后，可見(jiàn)Vpr組細(xì)胞表達(dá)Vpr蛋白（圖2）。

2.3 Vpr對(duì)細(xì)胞HT-29細(xì)胞周期及凋亡的影響轉(zhuǎn)染72h后，Vpr組細(xì)胞處于G2／M期細(xì)胞比例顯著增加，與Control組及Adv組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），凋亡率顯著升高，實(shí)驗(yàn)組處于亞二倍體的細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）比率與Control組及Adv組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

2.4 Vpr對(duì)細(xì)胞HT-29Survivin mRNA及蛋白表達(dá)的影響在mRNA和蛋白水平，Survivin表達(dá)隨著Ad-Vpr感染復(fù)數(shù)的增加而降低，MOI 50時(shí)，Survivin mRNA表達(dá)水平與Control組及Adv組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Survivin蛋白表示水平與與Control組及Adv組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

表1 三組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布（n＝3；%，mean±SD）

圖2 Western blot和RT-PCR分析Survivin基因表達(dá)及Vpr蛋白表達(dá)情況

3 討論

大腸癌作為最常見(jiàn)的消化道實(shí)體腫瘤之一，由于凋亡抑制所致的原發(fā)及繼發(fā)耐藥是其重要致死原因［4］，尋找有效的抗大腸癌藥物具有重要意義。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Vpr可以有效抑制細(xì)胞HT-29的增殖，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制增強(qiáng)。

腫瘤細(xì)胞形成了多種機(jī)制來(lái)逃避細(xì)胞增值調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)及凋亡抵抗［5］，恢復(fù)細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要策略。vpr能夠有效阻滯細(xì)胞HT-29于G2／M期并誘導(dǎo)凋亡。

Survivin是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族（IAPS）的重要成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，全長(zhǎng)14.7Kb，其蛋白分子量大約16.2kD它可以抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖，高表達(dá)于包括人大腸癌的多種腫瘤細(xì)胞中。在結(jié)腸癌組織，Survivin蛋白特異性的高表達(dá)，而在癌旁正常的粘膜組織表達(dá)極低或不表達(dá)［6，7］，這提示Survivin蛋白與大腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，是理想的大腸癌治療靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)Vpr可以顯著下調(diào)大腸癌細(xì)胞HT－29Survivin的表達(dá)，Vpr對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29體外增殖抑制作用可能與Vpr下調(diào)HT-29細(xì)胞中的Survivin的表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Vpr對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29的增殖抑制作用是通過(guò)細(xì)胞周期阻滯及誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的，Vpr對(duì)細(xì)胞HT-29體外增殖抑制作用可能與Vpr下調(diào)HT-29細(xì)胞中的Survivin的表達(dá)有關(guān)。Vpr對(duì)大腸癌細(xì)胞HT-29的增殖抑制作用還需利用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，其影響細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路尚須進(jìn)一步深入研究。

［1］Zhang B，F(xiàn)eng X，Wang J，et al.Combined Antitumor Effect of AdbFGF-siRNA and Ad-Vpr on the Growth of Xenograft Glioma in Nude Mouse Model［J］.Pathol Oncol Res，2010.

［2］馮學(xué)泉，王金環(huán)，徐新女，等.重組腺病毒Vpr誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的體外研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2010，26（6）：553.

［3］馮學(xué)泉，徐軍，王金環(huán)，等.LR重組法構(gòu)建重組腺病毒rAd5-Vpr［J］.天津醫(yī)藥，2008（11）.

［4］Zhang Y，Yuan J，Zhang H Y，et al.Natural resistance to apoptosis correlates with resistance to chemotherapy in colorectal cancer cells［J］.Clin Exp Med，2011.

［5］D.Hanahan，R.A.Weinberg，Cell，100（2000）：57.

［6］Liang Q L，Wang B R，Li G H.DcR3and survivin are highly expressed in colorectal carcinoma and closely correlated to its clinicopathologic parameters［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10（9）：675.

［7］田智丹，焦學(xué)信，任勇亞，等.survivin、cyclin D1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（1）：12.

Inhibition of the proliferation of HT-29and the expression of survivin in HT-29cells by Vpr

ZHANGHan-chao1，MA Bo2＊.（1.TianjinUniversityofTCM，Tianjin300193，China；2.DepartmentofGastrointestinalSurgery，Tianjin FourthCenterHospital，AffiliatedTianjinMedicalUniversity，Tianjin300140，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Vpr on proliferation of HT-29and expression of Survivin gene.MethodsHT-29cells were treated with Ad-Vpr or Adv for five days，The cell proliferation was measured by MTT assay everyday.72hpost treatment，F(xiàn)low cytometry（FCM）was employed to detect the cell cycle distribution and apoptosis.The expression of Vpr protein was detected by western blot；The rnRNA and protein expression levels of Survivin was determined by RT-PCR or Western blot.ResultsMTT showed that Vpr significantly inhibited the proliferation of HT-29cells（72hpost treatment，MOI＝200P＜0.05vs.control or Adv group）in a time dependent manner.The results of FCM showed that Vpr markedly increased the ratio of apoptosis（72hpost treatment，MOI＝200，P＜0.01vs.control or Adv group）and cells in G2／M cell cycle（72hpost treatment，MOI＝200，P＜0.05vs.control or Adv group）.RT-PCR and Western blot showed that Vpr significant1ly downregulated the expression levels of Survivin（72h post treatment，MOI：50，P＜0.05orP＜0.01vs.control or Adv（MOI＝200）group）.ConclusionVpr inhibits the proliferation of HT-29in vitro by inducing cell cycle arrest and apoptosis.and Vpr significant1ly downregulated the expression of survivin.Vpr is a potential anticancer agent for colorectal cancer.

HIV-1；Vpr；colorectal cancer；G2／M arrest；apoptosis；survivin

R735.3

A

1007－4287（2012）07－1157－03

＊通訊作者

2011－08－07）