劉麗琴，張海燕，王 捷＊

（1.南方醫(yī)科大學 研究生學院，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 醫(yī)學實驗科，廣東 廣州 510010）

KRAS基因突變高分辨率熔解曲線檢測技術參數(shù)的優(yōu)化

劉麗琴1，2，張海燕2，王 捷2＊

（1.南方醫(yī)科大學 研究生學院，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 醫(yī)學實驗科，廣東 廣州 510010）

目的 建立KRAS基因突變高分辨率熔解曲線分析法（high resolution melting，HRM）檢測方法，確立最佳反應體系和反應條件，為將此技術用于臨床基因突變的快速檢測奠定基礎。方法根據(jù)引物Tm值設立退火溫度梯度，確定適宜的退火溫度。利用正交實驗，對影響實時熒光定量PCR（qPCR）-HRM反應體系的模板DNA、Mg2＋、引物等3種主要因素進行優(yōu)化。通過對SW480和MDA-MB-231細胞基因組DNA進行HRM分析檢測突變，并直接測序驗證，觀察反應體系和反應條件的可行性。結(jié)果引物最適退火溫度為60.8℃。KRAS基因突變qPCR-HRM最佳反應體系為：20μl qPCR-HRM 反應體系中，引物濃度為0.5μmol／L，Mg2＋為2.5mmol／L，模板DNA為40ng。優(yōu)化的qPCR-HRM反應體系和反應條件能檢測基因突變，和直接測序結(jié)果一致。結(jié)論采用正交實驗優(yōu)化的qPCRHRM反應體系，操作簡便，電泳條帶清晰，熔解曲線峰型單一，特異性好，結(jié)果準確可靠，可為進一步建立HRM技術檢測基因突變的臨床應用提供借鑒。

突變；高分辨率熔解曲線；正交實驗；優(yōu)化

（ChinJLabDiagn，2012，16：1167）

高分辨率熔解曲線分析法（high resolution melting，HRM）是在實時熒光定量PCR基礎上通過飽和染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化進行分析的一種新興分子診斷技術。HRM檢測無需使用序列特異性探針，不受突變堿基位點和種類的局限，具有高靈敏度、高特異性、操作簡便、低成本、高通量、閉管操作等優(yōu)點［1，2］，可檢測石蠟包埋組織塊、血液、糞便等多種來源標本。HRM技術不損傷DNA，分析之后可以直接純化測序，可應用于基因分型、突變掃描等多方面［3，4］。

近些年來，結(jié)直腸癌治療領域中最大亮點是確定KRAS基因狀態(tài)與抗EGFR單體療效的相關性，KRAS基因野生型者從西妥昔單抗聯(lián)合化療中獲益更大［5］。KRAS基因突變檢測可以指導臨床選擇合理的治療方案，預測抗EGFR單抗療效，是實現(xiàn)結(jié)直腸癌個體化治療的必檢指標。本研究旨在對qPCR-HRM的反應體系和反應條件進行優(yōu)化，選擇最佳退火溫度、引物濃度和模板量，建立一種快速準確的突變檢測方法，為HRM技術檢測KRAS基因突變的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料選取HT29人結(jié)腸癌細胞系、SW480人結(jié)腸癌細胞系和MDA-MB-231人乳腺癌細胞系作為優(yōu)化qPCR-HRM方法技術參數(shù)的標準品，HT29細胞系為KRAS基因野生型，SW480細胞系為KRAS基因第12密碼子G12V突變型，MDA-MB-231細胞系為KRAS基因第13密碼子G13D突變型。

1.2 儀器與試劑Rotor-Gene 6000分析儀（QIAGEN，德國），瓊脂糖凝膠電泳儀（DYY-8B型，北京六一儀器廠），BIO-RAD GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂），TaKaRa廣譜型DNA純化試劑盒（DV811A），Nanodrop 2000紫外分光光度計，Typeit HRM PCR kit（QIAGEN），BIOER XP基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）。

1.3 引物的設計與合成根據(jù)KRAS基因片段序列（NC-000012.11），運用primer premier 5.0軟件設計能擴增出包括整個2號外顯子的引物，并用BLAST驗證引物的特異性。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 基因組 DNA 提取MDA-MB-231細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，HT29和SW480細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，均于37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液與傳代，待細胞生長至對數(shù)生長期時，用TaKaRa廣譜型DNA純化試劑盒提取細胞基因組DNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 PCR反應條件的優(yōu)化以KRAS野生型HT29細胞DNA為模板，做梯度PCR，摸索最佳退火溫度。用Nanodrop 2000紫外分光光度計測DNA濃度，并將DNA濃度稀釋至30ng／μl，引物濃度為10μmol／L。根據(jù)引物Tm值，設立11個梯度的退火溫度，從低到高依次為45.0℃、46.4℃、47.6℃、49.2℃、51.9℃、54.8℃、57.0℃、57.9℃、60.8℃、62.9℃和64.0℃，在BIOER XP基因擴增儀上進行梯度PCR反應。PCR反應體系為20μl，組成如下：2×HRM PCR Master Mix緩沖液10 μl，引物 KRAS-F和 KRAS-R各0.4μl，模板 DNA 1μl，RNase-free water 8.2μl。PCR 反應條件為95℃預變性10min；95℃變性20s，退火20s，72℃延伸20s；40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，90V恒壓電泳40 min，置于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.6 PCR反應體系的優(yōu)化以模板DNA、引物和MgCl2為實驗因素，進行3因素3水平的正交實驗優(yōu)化反應體系（表1），即選用L9（34）正交表進行9種組合的實驗（表2）。

表1 qPCR-HRM反應體系正交實驗的水平和因素

表2 反應體系正交實驗設計表L9（34）

1.7 HRM分析技術檢測基因突變 用優(yōu)化的qPCR-HRM反應體系和反應條件對HT29、SW480和MDA-MB-231細胞DNA進行PCR擴增并分析熔解曲線，用HT29細胞DNA樣品做KRAS基因野生標準品，HRM方法分析檢測SW480和MDAMB-231細胞DNA是否為KRAS基因第2外顯子突變，并進行直接測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度的優(yōu)化3%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，目的片段為168bp。電泳顯示，從45.0℃－64.0℃這11個溫度溫度梯度，差異明顯。泳道1、2、3和4擴增的非特異性條帶多，■泳道5～11均能擴增出目的條帶，條帶清晰，特異性好。泳道9擴增條帶最清晰明亮，選定泳道9所對應的60.8℃為最適退火溫度。見圖1。

圖1 溫度梯度PCR結(jié)果

2.2 正交實驗優(yōu)化qPCR-HRM反應體系通過3因素3水平的正交實驗，共9種實驗組合，對qPCRHRM反應體系進行了優(yōu)化。第5組合擴增曲線斜率較大，熔解曲線為高而窄的單一峰，電泳條帶相對清晰、明亮。結(jié)合PCR擴增曲線、熔解曲線和PCR產(chǎn)物電泳圖分析可得，第5實驗組合為最佳反應體系：20μl qPCR-HRM 反應體系中，引物濃度為0.5 μmol／L，Mg2＋為2.5mmol／L，模板 DNA 為40ng（圖2和圖3）。

圖2 正交實驗qPCR-HRM擴增曲線和熔解曲線

圖3 正交實驗qPCR-HRM反應體系優(yōu)化電泳圖

2.3 HRM分析檢測基因突變以 HT 29細胞DNA樣品作為KRAS基因野生標準品，HRM分析檢測SW480和 MDA-MB-231細胞DNA均為KRAS基因2號外顯子突變型，直接測序結(jié)果和HRM分析結(jié)果一致，SW480細胞為KRAS基因G12V突變型（GGT＞GTT），MDA-MB-231細胞為 KRAS基因G13D突變型（GGC＞GAC）。HRM分析結(jié)果見圖4，反向直接測序結(jié)果見圖5。

3 討論

HRM分析方法是在實時熒光定量PCR基礎上通過飽和熒光染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化進行分析的一種技術，所以qPCR的反應體系和反應條件直接影響HRM的結(jié)果分析。

圖4 細胞樣品HRM分析結(jié)果

PCR反應受許多因素影響，不同的引物具有不同的最適退火溫度，退火溫度的高低直接影響PCR擴增結(jié)果。溫度過低，特異性差，非特異性條帶多，溫度過高會影響引物和模板的結(jié)合，擴增效率低，甚至無PCR產(chǎn)物擴增。本研究設置45.0℃－64.0℃11個梯度的退火溫度，其中，60.8℃擴增的條帶清晰、明亮，將其作為最適退火溫度。

圖5 細胞樣品反向測序峰圖

本研究采用3因素3水平的正交實驗，對qPCR-HRM反應體系進行優(yōu)化，建立了最佳的反應體系，在動態(tài)環(huán)境中考慮到PCR反應各因素的相互作用。因為各因素濃度過低時，可能無法擴增出產(chǎn)物；濃度過高時，非特異性條帶可能增多及出現(xiàn)彌散狀背景。Mg2＋對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，是TaqDNA聚合酶活性所必需的，Mg2＋濃度過高，反應特異性降低，不同反應之間對反應要素的競爭不平衡，表現(xiàn)為條帶亮度不均一，甚至也會出現(xiàn)非特異性擴增；濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少，表現(xiàn)為條帶整體變暗甚至消失。模板DNA和引物的用量也直接影響PCR結(jié)果。過高的模板會螯合Mg2＋，降低TaqDNA聚合酶活性，產(chǎn)生非特異性擴增；模板濃度太低，則擴增效率降低。引物濃度過高，易引起非特異性擴增及形成引物二聚體。從節(jié)約的角度考慮，只要能擴增出清晰、明亮、穩(wěn)定的條帶，模板DNA、Mg2＋和引物的用量應越低越好。在圖3中，泳道5、6、8擴增的條帶均較明亮清晰，但結(jié)合擴增曲線和熔解曲線，綜合考慮各因素的濃度，選擇泳道5對應的各因素濃度作為最佳的qPCR-HRM反應體系。

用優(yōu)化的qPCR-HRM反應體系和反應條件檢測SW480和 MDA-MB-231細胞DNA突變，操作簡便省時，閉管操作，避免污染，成本低，結(jié)果準確可靠，和直接測序法結(jié)果一致。直接測序法目前雖是檢測基因突變的金標準，但操作繁瑣，容易交叉污染，成本高，檢測靈敏度低，不適合臨床常規(guī)檢測。HRM分析方法不僅用于檢測基因突變，還可用于基因分型、甲基化研究、RNA編輯等方面，有望成為分子診斷的常規(guī)方法。

［1］Vossen RH，Aten E，Roos A，et al.High-Resolution Melting A-nalysis（HRMA）：More ThanJust Sequence Variant Screening［J］.Hum Mutat，2009，30（6）：860.

［2］Erali M，Wittwer CT.High resolution melting analysis for gene scanning［J］.Methods，2010，50（4）：250.

［3］Vandersteen JG，Bayrak-Toydemir P，Palais RA，et al.Identifying common genetic variants by high-resolution melting［J］.Clin Chem，2007，53（7）：1191.

［4］Erali M，Voelkerding KV，Wittwer CT.High resolution melting applications for clinical laboratory medicine［J］.Exp Mol Pathol，2008，85（1）：50.

［5］Soulières D，Greer W，Magliocco AM，et al.KRAS mutation testing in the treatment of metastatic colorectal cancer with anti-EGFR therapies［J］.Curr Oncol，2010，17：S31.

The Optimization of High Resolution Melting Analysis for KRAS Gene Mutations Detection

LIULi-qin1，2，ZHANGHaiyan2，WANGJie2.（1.GraduateInstituteofSouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，China；2.Departmentof MedicalResearch，GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Guangzhou510010，China）

ObjectiveTo establish the optimal reaction system and reaction conditions of high resolution melting for KRAS mutations detection，and lay the foundation for the rapid detection on the clinical genetic mutations.MethodsThe gradients of annealing temperature were set according to Tm value of primer in order to determine the appropriate annealing temperature.The orthogonal test was used to optimize qPCR-HRM reaction system in the three factors including DNA template，MgCl2and Primer.Through the SW480and MDA-MB-231cell lines KRAS mutations detected by HRM and direct sequencing，estimating the feasibility of reaction system and reaction conditions.ResultsThe optimal annealing temperature was 60.8℃.The optimization of 20μl qPCR-HRM reaction system including DNA template 40 ng，MgCl22.5mmol／L and Primer 0.5μmol／L was established by Orthogonal Design.The results between HRM and direct sequencing were consistent.ConclusionIt was simple，specific，accurate and reliable，and with clear electrophoretic bands and single melting curve peak to optimize qPCR-HRM reaction system by orthogonal test.This would provide a reference for the further development of rapid mutation detection by HRM on the clinical application.

mutation；high resolution melting；orthogonal test；optimization

R392

A

1007－4287（2012）07－1167－04

＊通訊作者

劉麗琴（1986-），女，南方醫(yī)科大學在讀碩士研究生，主要研究方向：腫瘤分子診斷研究。

2011－12－24）