秦天呈 姚彬 王文 滕燕 孟俊杰 曾蔚

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院2009級(jí)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)基地班，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，四川 成都 610041）

1 噬菌體早期研究實(shí)驗(yàn)

噬菌體是由英國細(xì)菌學(xué)家Twort（1915）及法裔加拿大細(xì)菌學(xué)家D’Herelle（1917）分別發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)菌病毒。他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，噬菌體具有使宿主細(xì)菌裂解的現(xiàn)象，從而提出了噬菌體應(yīng)用于治療的可能性［1］。早在D’Herelle發(fā)現(xiàn)噬菌體的當(dāng)年，他就在臨床上進(jìn)行了第一次噬菌體治療實(shí)驗(yàn)，其有效性得到了證明，但由于此次實(shí)驗(yàn)缺乏嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因而不被科學(xué)界所認(rèn)可［2］。而后，D’Herelle又用直接注射的方法使四名患有鼠疫的病患全部康復(fù)［3］。早期的噬菌體研究主要集中在蘇聯(lián)和東歐，但由于抗生素的出現(xiàn)和世界政治格局的變化，噬菌體的研究逐漸停滯不前。

六十年代末，我國醫(yī)學(xué)工作者用噬菌體治療燒傷引起的銅綠假單胞桿菌感染，取得了很好的效果［4］，七八十年代以來，西方國家大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也讓人們深刻的意識(shí)到：噬菌體作為抗感染生物制劑，在臨床上的應(yīng)用是有一定前景的［5，6］，甚至可能作為繼抗生素之后，人類對(duì)抗細(xì)菌感染的又一有效武器。

2 噬菌體的當(dāng)代研究狀況

近年來，隨著抗生素的治療效果日趨下降，耐藥菌種的不斷出現(xiàn)，世界各地的研究人員又將目光重新聚集到了噬菌體的身上。使噬菌體不僅在抗感染的治療中發(fā)揮巨大作用，在臨床的各種檢測(cè)中也作出了卓越的貢獻(xiàn)。2003年，美國就發(fā)現(xiàn)第一例抗萬古霉素的金葡，而在利用小鼠模型作為檢驗(yàn)應(yīng)用噬菌體治療效果時(shí)，顯示了噬菌體具有顯著的保護(hù)作用［7］。而在2011年，巴斯德實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的關(guān)于噬菌體治療銅綠假單胞菌感染引起的肺囊性纖維化小鼠模型的實(shí)驗(yàn)論文中，也證實(shí)應(yīng)用噬菌體治療取得了很好的治療效果：在有效治療劑量作用下，2小時(shí)后小鼠的存活率達(dá)到95%，而在四天的正常治療劑量后，治愈率可達(dá)100%［8］。

(1)燃油管路、燃油濾清器進(jìn)入空氣或阻塞按前術(shù)方法排空氣或更換燃油濾清器芯子。(2)噴油泵供油不良檢查修理或更換偶件。(3)噴油器霧化不良或油壓力低進(jìn)行噴霧觀察或調(diào)整噴油壓力，并檢查噴油嘴偶件或更換。

3 噬菌體殺菌機(jī)制及特點(diǎn)

噬菌體有嚴(yán)格的宿主特異性，不能感染人體內(nèi)的細(xì)胞，僅寄居在易特異宿主菌體內(nèi)。噬菌體具有高度的特異性，一種噬菌體往往只侵染一種細(xì)菌，或只侵染某一菌株。按生活周期可將噬菌體可分為烈性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。侵入宿主細(xì)胞后，引起宿主菌快速裂解的噬菌體被稱作烈性噬菌體。另一種稱為溫和噬菌，其侵入宿主細(xì)胞后，可以出現(xiàn)兩種反應(yīng)，一種是與烈性噬菌體相同的裂解反應(yīng)，另一種則是以前噬菌體的形式附著并整合在宿主菌的染色體上，使宿主菌不裂解而繼續(xù)生長，表達(dá)病毒基因。從噬菌體治療的角度考慮，溫和噬菌體的可利用價(jià)值不高，故通常提到的噬菌體為烈性噬菌體。

噬菌體制劑通過離心就可以去除細(xì)菌碎片得到純化，易于保存和運(yùn)輸。且從進(jìn)化的觀點(diǎn)來看，完全可以通過自然選擇來篩選噬菌體治療耐藥或耐噬菌體的細(xì)菌感染，這是抗生素所無法比擬的。

第三，形成了一些比較有效的課堂規(guī)范，但也有一些課堂規(guī)范阻礙了學(xué)生的自由發(fā)展.張老師經(jīng)過多年的教學(xué)實(shí)踐，形成了自己的一套課堂教學(xué)規(guī)范.如一個(gè)學(xué)生在回答問題時(shí)，要求其他學(xué)生保持安靜，待這位學(xué)生講完后再發(fā)表意見.這樣的課堂規(guī)范，有利于養(yǎng)成學(xué)生學(xué)會(huì)傾聽，并對(duì)他人的觀點(diǎn)進(jìn)行思考的習(xí)慣.但是還有一些課堂規(guī)范不利于學(xué)生的自由發(fā)展，如要求學(xué)生想到解答方法或獲得答案后不能隨便發(fā)言，等老師點(diǎn)名后才可以回答；再如，要求學(xué)生統(tǒng)一解題思路后，再動(dòng)手做題.

其中:x(t)=(x1(t),x2(t),…,xN(t))T為N 維狀態(tài)向量;u(t)=(u1(t),u2(t),…,um(t))T為控制向量;mN；f(x(t),u(t),t)=(f1(x(t),u(t),t),f2(x(t),u(t),t),…,fN(x(t),u(t),t))T為N維實(shí)值函數(shù)向量.為了研究問題的方便,引入廣義狀態(tài)空間的概念.

工序加工能耗包括工序加工過程中的切削過程能耗、空切過程能耗、工件裝夾過程能耗和磨頓換刀過程能耗[11]。因此，調(diào)度過程中的工序加工能耗

3.1 吸附識(shí)別和穿入

抗生素多數(shù)是以破壞致病菌與非致病菌為目標(biāo)的廣譜性藥物，因而很可能破壞機(jī)體或目標(biāo)環(huán)境的菌群平衡，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的二次感染。傳統(tǒng)抗生素治療在殺滅致病菌的同時(shí)，也破壞了消化道及泌尿生殖道等部位的正常菌群，從而導(dǎo)致菌群失調(diào)，引起機(jī)會(huì)性感染甚至更嚴(yán)重的全身性感染。而噬菌體擁有嚴(yán)格的宿主特異性［11］，只針對(duì)相應(yīng)的宿主菌，而不會(huì)破壞正常菌群，避免二次感染。

3.2 溶菌

通過對(duì)噬菌體的溶菌基因及溶菌過程的研究初步認(rèn)為，噬菌體對(duì)其宿主菌的溶解是由專一溶解基因編碼的特異性蛋白或噬菌體自身蛋白介導(dǎo)的溶解系統(tǒng)統(tǒng)一完成的，這一溶解系統(tǒng)具有一套完整、精密的調(diào)節(jié)機(jī)制和控制體系，而且其作用基質(zhì)多集中宿主菌的細(xì)胞壁上，噬菌體蛋白通過不同的途徑影響和破壞宿主菌胞壁質(zhì)的生物合成及正常結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致噬菌體宿主菌細(xì)胞損傷、死亡。

噬菌體對(duì)細(xì)菌的感染效率驚人，重復(fù)4個(gè)感染周期后，一個(gè)噬菌體顆粒可殺滅數(shù)10億個(gè)細(xì)菌，這是噬菌體極具特色的一種生物學(xué)特性。由于具備強(qiáng)大的殺菌能力，噬菌體在治療細(xì)菌感染、消毒以及反生物武器等領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。

4 噬菌體作為治療性制劑的優(yōu)勢(shì)

抗生素作為上個(gè)世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的藥物，隨著大量的生產(chǎn)和使用，對(duì)細(xì)菌造成了選擇性的壓力，在我國及世界各地都接連發(fā)現(xiàn)了耐藥的、甚至是多重耐藥的超級(jí)細(xì)菌，給臨床治療帶來了極大的困難［10］。而噬菌體作為更早發(fā)現(xiàn)的生物制劑，雖然目前的研究還不夠成熟，但在面對(duì)細(xì)菌選擇性和針對(duì)細(xì)菌專一性方面都具有明顯的優(yōu)越性。

4.1 噬菌體殺菌有嚴(yán)格的宿主特異性，不會(huì)破壞正常菌群

不同的噬菌體吸附宿主菌的部位是不同的，通常噬菌體的尾端吸附于細(xì)菌的表面，有尾噬菌體多以尾絲吸附宿主菌的外膜蛋白，另外，噬菌體能否吸附于菌株主要取決于該特異宿主細(xì)胞是否具有噬菌體的結(jié)合受點(diǎn)，不同的噬菌體受點(diǎn)位于細(xì)胞壁的層次不盡相同，大多數(shù)噬菌體如λ噬菌體和P22噬菌體則吸附于細(xì)菌的細(xì)胞壁組分，例如磷壁酸或多糖（革蘭氏陽性菌），脂多糖或蛋白質(zhì)（革蘭氏陰性菌），絲狀噬菌體則多吸附于細(xì)菌的性菌毛上。噬菌體的穿入是個(gè)極其快速的過程，但速率明顯受到溫度、結(jié)構(gòu)、及其他理化因子的影響。

4.2 噬菌體治療效果不因細(xì)菌耐藥性而改變

一些在某些情況下對(duì)宿主菌具有較強(qiáng)裂解作用的噬菌體，在某些特定條件下會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，其基因組在進(jìn)入宿主菌體后不表達(dá)溶菌物質(zhì)，而是整合到宿主菌基因組上，成為溶原性噬菌體，不但不適用于臨床治療，更有可能使宿主菌獲得毒力因子。

因?yàn)榍懊鎺状伟嗉?jí)活動(dòng)都是學(xué)生自己策劃的，所以，今年的班級(jí)生日會(huì)，我完全放手讓學(xué)生操辦，我只作為顧問幫助策劃者排憂解難。在籌劃過程中，小蝶作為主負(fù)責(zé)人，經(jīng)常詢問我生日會(huì)的環(huán)節(jié)是否合適。

4.3 噬菌體治療的效率高

根據(jù)抗生素的藥代動(dòng)力學(xué)，抗生素會(huì)進(jìn)入機(jī)體的新陳代謝，并且最終被排出體外，不能集中在感染部位，而噬菌體只在感染部位增殖，并且增殖很快，只需極少量的噬菌體就可以完成大量殺滅細(xì)菌的工作。

4.4 噬菌體治療的副作用少

很少有噬菌體治療引起嚴(yán)重副反應(yīng)的報(bào)道，偶爾可出現(xiàn)輕微的細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)，但都在可控制的范圍之內(nèi)。Bruttin等［14］讓一些健康的志愿者口服純化后的T4噬菌體制劑，與對(duì)照組相比，未見不良的癥狀，并且足夠的證據(jù)證明：用噬菌體治療細(xì)菌性感染是很安全的，即使是一些存在免疫缺損的病人服用噬菌體制劑也無異常癥狀。

4.5 噬菌體制劑研發(fā)所需的時(shí)間短，成本低

五六十年代，濟(jì)寧林業(yè)遭受很大破壞，森林資源持續(xù)減少。隨后全國迎來了改革開放，濟(jì)寧開始大規(guī)模推進(jìn)國土綠化，通過完善造林綠化政策、簽訂綠化目標(biāo)責(zé)任狀、實(shí)施工程造林等多種措施，造林綠化穩(wěn)步推進(jìn)，森林資源持續(xù)增長，截至目前，全市林木綠化覆蓋率達(dá)到32.21%。

5 噬菌體治療面臨的問題

5.1 引發(fā)免疫反應(yīng)

噬菌體本身具有較強(qiáng)的免疫原性，進(jìn)入人體后會(huì)受到免疫系統(tǒng)攻擊。雖然噬菌體在到達(dá)感染部位并識(shí)別宿主細(xì)菌后能迅速產(chǎn)生裂菌作用，但相當(dāng)數(shù)量的噬菌體在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)就已經(jīng)被固有免疫系統(tǒng)所攔截，并失去活性，這就使靜脈注射噬菌體的效率大為降低。馬曉麗等人檢測(cè)了M13噬菌體在血液中的殘余活性時(shí)間梯度，發(fā)現(xiàn)活性噬菌體的數(shù)量在注射入血后的數(shù)量隨時(shí)間驟降，5min后剩余約50%，15min時(shí)已減少至不到20%。同時(shí)該研究組認(rèn)為，血清中存在的因子可能是導(dǎo)致噬菌體失活的主要因素，且很可能是由IgM介導(dǎo)的補(bǔ)體所引發(fā)［15］。

噬菌體基因組中包含有改變細(xì)菌致病性的片段，使得溶原性轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)菌產(chǎn)生一系列表型變化，導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)毒性或毒性增強(qiáng)，例如白喉棒狀桿菌產(chǎn)生白喉毒素，以及C型和D型肉毒梭菌產(chǎn)生肉毒神經(jīng)毒素。

5.2 鑒別溫和噬菌體與烈性噬菌體

噬菌體與抗生素的作用機(jī)制完全不同，治療效果不因細(xì)菌耐藥性而改變。所以他們能夠有效的治療那些由耐藥性細(xì)菌所引起的疾病。Carlon［12］指出，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的突變頻率是10－6，而對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的突變頻率為10－7，聯(lián)合用藥的雙突變率降為10－13。并且噬菌體可產(chǎn)生一定程度的變異用以適應(yīng)宿主菌的變異，傳統(tǒng)抗生素則不具備這種優(yōu)勢(shì)。Biswas等在2002年曾經(jīng)報(bào)道過，他們運(yùn)用噬菌體成功地治療了感染了耐萬古霉素屎腸球菌（Vancomycinresistant Enterococcus faecium，VRE）的小鼠［13］。

5.3 藥物動(dòng)力學(xué)特征復(fù)雜

與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比，噬菌體的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征更為復(fù)雜。由于噬菌體具有獨(dú)特的增殖方式及免疫原性，其在體內(nèi)的代謝情況除與噬菌體種類有關(guān)外，還受到細(xì)菌數(shù)量及代謝狀態(tài)、人體免疫系統(tǒng)的影響，不同噬菌體具有不同的藥物動(dòng)力學(xué)特征，噬菌體的體外生長數(shù)據(jù)也不能直接運(yùn)用到體內(nèi)［16］，因而造成給藥時(shí)機(jī)和劑量不易把握的困難。

5.4 細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性問題

噬菌體的宿主菌可能會(huì)通過突變獲得對(duì)噬菌體的抗性，這點(diǎn)與細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥突變相似。雖然這一轉(zhuǎn)變發(fā)生的頻率遠(yuǎn)低于耐藥突變，但仍然有可能成為噬菌體治療中的一大困難。

所有真細(xì)菌的噬菌體最終都是以裂解宿主細(xì)胞的方式來終止?fàn)I養(yǎng)周期，釋放子代病毒。一般噬菌體對(duì)細(xì)菌的破壞分兩步進(jìn)行［9］：

5.5 噬菌體攜帶的毒力因子

After the tensile experiment, the relationship of tensile force and distance is shown as Figure 3.

美國作家張純?nèi)绮贿@么看。張純?nèi)?6歲那年，在美國斯坦福大學(xué)，參加了一次紀(jì)念南京大屠殺遇難者的追思會(huì)。會(huì)上，張純?nèi)绫荒暇┐笸罋⒀鹊臍v史圖片震驚。那些“毫無掩飾的黑白圖像：被砍下的頭顱、被開膛的腹腔以及裸體的婦女，強(qiáng)奸她們的士兵迫使她們做出各種色情的姿勢(shì)，她們的臉上則露出了令人難忘的痛苦和羞辱的表情”。這些照片，成為張純?nèi)鐚懽鳌赌暇┍┬校罕贿z忘的大屠殺》的直接動(dòng)因。

5.6 細(xì)菌裂解釋放內(nèi)毒素

在噬菌體治療過程中，不僅體內(nèi)宿主菌被噬菌體裂解后會(huì)釋放大量內(nèi)毒素，而且在噬菌體制劑的制備提純過程中也很難避免細(xì)菌內(nèi)毒素的混入，使噬菌體制劑在體內(nèi)的使用遭遇困難。

6 噬菌體治療的展望

6.1 篩選較寬噬菌譜的噬菌體

噬菌體具有嚴(yán)格的宿主專一性，這使其在細(xì)菌分型、檢測(cè)及特異性殺傷方面具有優(yōu)勢(shì)；而過于嚴(yán)格的專一性使得噬菌體僅能對(duì)特定型別的宿主菌產(chǎn)生作用，給臨床治療帶來困難，因此，需要篩選能夠殺傷多種細(xì)菌亞型的噬菌體，或通過基因改造獲得具有較寬噬菌譜的噬菌體。早期研究中，Merril等人通過向小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)注射噬菌體，篩選到能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)誘捕從而在體內(nèi)長期存活的突變株，即“長期循環(huán)”表型噬菌體，從而獲得與親本噬菌體相較更理想的治療效果［17］。而在現(xiàn)代研究中，利用基因技術(shù)解析已知寬噬噬菌體的基因序列，對(duì)其他噬菌體進(jìn)行基因改造以使其獲得較寬噬菌譜，將使噬菌體更適合于臨床應(yīng)用。

6.2 優(yōu)化給藥途徑

局部病灶直接給藥能避免循環(huán)系統(tǒng)對(duì)噬菌體的免疫作用，從而降低噬菌體被清除的可能性。對(duì)于噬菌體難以直接接觸的胞內(nèi)寄生菌，如結(jié)核分枝桿菌和鳥分支桿菌，利用恥垢分枝桿菌作為載體向吞噬細(xì)胞內(nèi)傳遞噬菌體，從而殺滅胞內(nèi)的鳥分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌［17－19］。另外，也有研究利用脂質(zhì)體作為載體將噬菌體送入胞內(nèi)從而達(dá)到治療效果［20］。

6.3 篩選強(qiáng)裂解性噬菌體

噬菌體的裂解性越強(qiáng)，治療宿主菌的感染越有效。通過噬菌斑的大小反復(fù)多次篩選，可以獲得針對(duì)同種宿主菌的強(qiáng)烈解性噬菌體。

6.4 避免噬菌體所攜帶的毒力因子

一些噬菌體攜帶有毒素基因，其編碼的一些調(diào)控因子或酶參與細(xì)菌毒性的表達(dá)。

6.5 減少裂解導(dǎo)致的內(nèi)毒素釋放量

噬菌體介導(dǎo)的裂解使細(xì)菌內(nèi)毒素大量釋放，由此可能引起經(jīng)過基因修飾的非裂解性噬菌體，如溶菌酶缺陷型噬菌體可以殺死宿主細(xì)菌而不使其發(fā)生裂解，從而避免內(nèi)毒素的釋放。通過基因修飾改造線狀噬菌體，能夠產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌致命的蛋白質(zhì)，但不使細(xì)菌裂解，在達(dá)到殺菌目的的同時(shí)減少內(nèi)毒素釋放［21］。

6.6 建立針對(duì)臨床病原菌分離株的噬菌體庫

由于噬菌體對(duì)宿主具有嚴(yán)格的選擇性，因此對(duì)于任意特定種類的細(xì)菌，都需要應(yīng)對(duì)以相應(yīng)的高敏感性噬菌體，這就需要收集和篩選大量的專一性噬菌體保存，以建立較為完備的噬菌體庫。

7 結(jié)束語

綜上所述，近年來不斷開展的噬菌體抗感染治療實(shí)驗(yàn)表明，噬菌體作為新型抗感染藥物，具有廣闊的發(fā)展前景。特別在面對(duì)多重耐藥細(xì)菌感染的治療上，噬菌體制劑具有明顯的優(yōu)越性。但目前需要進(jìn)一步研究噬菌體在體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)問題，迫切需要解決問題有噬菌體的寬噬性和噬菌體制劑安全性等。希望通過不斷地探索實(shí)驗(yàn)，使噬菌體的抗感染治療方法得到不斷的完善，同時(shí)也使人們?cè)诳垢腥狙芯糠矫嫒〉猛黄菩缘倪M(jìn)展。

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