河南省職業(yè)病防治研究院 肖慶鋒 秦文華

生物材料中化學毒物快速鑒定技術研究*

河南省職業(yè)病防治研究院 肖慶鋒 秦文華

生物樣品檢測，即檢測人體內生物材料中化學物質或其代謝產物的含量，常用來評價人體接觸化學物質的程度以及可能造成的健康影響。對職業(yè)人群的生物樣品檢測，可以用來長期監(jiān)測職業(yè)環(huán)境中有害因素的濃度。生物樣品的檢測與環(huán)境監(jiān)測相輔相成，為評價職業(yè)有害因素對人體的危害提供科學依據(jù)。對生物監(jiān)測指標的檢測，尤其是對健康效應指標的檢測，有助于發(fā)現(xiàn)和確定易感人群，篩檢不宜從事某項工種的人群，從而減少職業(yè)病的發(fā)生。生物樣品的檢驗能較為準確地測量勞動者體內有害物質的含量，在職業(yè)流行病學調查和外源性化學物危險度評價中經常被采用。本文，筆者利用原子吸收分光光度計、氣相色譜儀、分光光度計和電化學分析儀等儀器，結合捕集阱頂空預分離技術，系統(tǒng)研究了一些化學毒物的鑒定技術，為評價人體接觸化學毒物的程度與可能造成的健康影響提供必要的檢測手段，并且為化學中毒應急救治提供依據(jù)。

一、生物樣品中無機化學毒物快速鑒定技術研究

1.原子熒光測定法測定尿液、血液中銻的含量。

（1）測定原理。將樣品經濕法消解后，在酸性條件下，加入硫脲和抗壞血酸，使五價銻預還原為三價銻，再加入硼氫化鈉或硼氫化鉀使三價銻還原生成銻化氫，將氬氣載入石英原子化器中，將銻化氫中的銻分解為原子態(tài)銻。原子態(tài)銻在銻空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)下產生原子熒光，原子熒光發(fā)光強度在固定條件下與被測液中的銻濃度成正比，因此可以通過檢測原子熒光發(fā)光強度來計算血液中銻的濃度。

（2）測定方法。取1 mL樣品放入錐形瓶中，加入3 mL H2O2和4.5 mL HNO3（即H2O2與HNO3體積比為2∶3），放置3 h，用恒熱電熱板在100℃時加熱處理30 min，再在110℃時加熱趕酸，直至近干，冷卻后轉移至5 mL比色管中，同時加入2.5 mL質量分數(shù)為10%的HCl，用質量濃度為10 g/L的抗壞血酸-硫脲混合液定容至5 mL。實驗過程中比較酸度、硼氫化鉀濃度、載氣及屏蔽氣流速等因素對測定結果的影響。樣品處理選用H2O2和HNO3的混合液作為消解試劑，所得結果精密度符合要求，且整個方法重現(xiàn)性好，取樣量少，靈敏度高，操作簡單、快速，基體干擾少，測定儀器價格低，適合于職業(yè)接觸或中毒人群尿液、血液中銻的含量分析。

2.微分電位溶出分析法測定生物材料中鎵的含量。將待測樣品置于10 mL的比色管中，分別加入適量的鎵標準溶液、0.2 mL質量分數(shù)為15%的KCl溶液、1 mL質量分數(shù)為0.15%的甲酸溶液和150 μg Hg2+，定容至5 mL，放入微分電位儀測定鎵含量。該方法不需要特殊試劑，樣品處理過程簡單，靈敏度高，可快速測定，回收率能夠控制在90%～111%。但是要消除溶液中各種金屬離子的干擾，消除方法方法如下。

（1）消除Zn2+的干擾。首先將富集電位調到-1.2 V，攪拌富集80 s；然后將電位調到-1.0 V，靜止富集30 s，使鋅從汞膜中溶出，從而減少互化物。

（2）消除Cu2+的干擾。選擇質量濃度為1 mg/L的鍺，以阻止銅與鎵的互化物的形成。

（3）消除Fe3+的干擾。待樣品消化完全后，取1mL質量分數(shù)為20%的鹽酸羥胺放入三角瓶中，在電熱板上加熱煮沸5 min，即可把Fe3+還原為Fe2+。

3.石墨爐原子吸收法測定尿液、血液中鉈的含量。

（1）尿液中鉈含量的測定。先將尿樣用質量分數(shù)為1%的HNO3酸化，再以PdCl2為基體改進劑消除干擾，然后使用石墨爐原子吸收法直接測定尿樣中鉈的含量。該方法質量濃度檢出限為0.56 μg/L，加標回收率為98.8%～101.5%，該方法簡單快速，精密度和穩(wěn)定性好，符合尿液中鉈的測定要求。

（2）血液中鉈含量的測定。由于血液的前處理過程比較復雜，且鉈為易揮發(fā)元素，容易在前處理過程中造成鉈損失，所以要先用質量分數(shù)為5%的HNO3酸化，再以質量濃度為1 g/L的釩為基體改進劑消除干擾，放入微分電位儀測定全血中的鉈含量，該方法操作簡便，靈敏度較高，符合血液中鉈檢測的要求。

4.微分電位溶出分析法測定臟器（肝、腎、肺）中的鉈。取樣品1 g，倒入聚四氟乙烯消化罐中，再加入3 mL消化液，在170℃時消化12 h，用物質的量濃度為5 mol/L的NaOH將pH值調為7，并定容至100 mL。取上述溶液1 mL倒入50 mL小燒杯中，加入物質的量濃度為0.3 mol/L的醋酸和物質的量濃度為0.25 mol/L的醋酸鉀緩沖溶液各5 mL、物質的量濃度為0.1 mol/L的EDTA2.5 mL和水16.5 mL，放入電位溶出分析法儀測定，用標準加入法定量（鉈的溶出電位為-0.7 V），該方法靈敏度、準確度高。

5.氫化物原子熒光測定法測定尿液中鉛的含量。將1.0 mL尿樣倒入濃HNO3蕩洗過的100 mL三角瓶中，加2 mL混合酸溶液（混合酸溶液中HNO3與HClO3體積比為3∶1），在電熱板上消化至無色近干后取下。加5.0 mL去離子水，搖勻后取2.0 mL置于一次性塑料管中，再加入0.4 mL混合溶液（由質量濃度為80 g/L的鐵氰化鉀和質量濃度為4 g/L的草酸、質量分數(shù)為8%的HCl組成）和1.6 mL去離子水，搖勻，放入原子熒光光度計測定。該方法質量濃度的檢出限為0.2 μg/L，相對標準偏差為2.7%。

6.涂鑭石墨管-石墨爐原子吸收光譜測定法測定尿液中的微量鋇。先將熱解平臺石墨管放入質量分數(shù)為5.4%的硝酸鑭溶液中浸泡24 h，再用超聲處理15 min，以趕盡石墨管表面的氣泡，使涂層均勻。自然風干后，放入烘箱中，在120℃條件下干燥2 h，把石墨管兩端及外面用紙擦干凈，以防止石墨管污染石墨錐。將其放入石墨爐中，在120℃條件下加熱30 s，900℃條件下加熱30 s，2 000℃條件下加熱10 s，2 600℃條件下加熱10 s，連續(xù)加熱3次，加熱時氬氣流速為250 mL/min。尿樣用100+2比例（尿樣與濃酸的體積比為100∶2）的濃酸消化，將有機物質破壞，使鋇以離子形式存在于待測液中，有利于鋇的原子化。該方法以質量分數(shù)為40%的硝酸銨和質量分數(shù)為6%的硝酸鎂為混合基體改進劑，改善尿樣中的基體，可以有效消除背景吸收，用質量分數(shù)為5.4%的硝酸鑭涂層平臺石墨管，能有效抑制碳化鋇的生成，此外，涂層石墨管也避免了高溫石墨管本身在可見區(qū)的強輻射，有利于尿樣中微量鋇的測定。該測定方法簡便，準確度高。

7.石墨爐原子吸收法直接測尿液、血清中鉻的含量。

（1）尿液中鉻含量的測定。尿樣按100+2的比例（尿樣和濃HNO3的體積比為100∶2）加入濃HNO3消化，采用質量分數(shù)為4%的NH4NO3為基體改進劑，用石墨爐原子吸收法測定尿液中鉻的含量。該方法用NH4NO3為基體改進劑，改善尿樣基體，減少背景干擾，樣品不需繁瑣的預處理，減少了樣品污染和損失的機會。該方法簡便、快速，適用于大批量的尿樣中鉻含量的測定，該方法測定的精密度和準確度較好，質量濃度檢出限為0.12 μg/L。

（2）血清中鉻含量的測定。將血清用濃HNO3酸化，以質量濃度為4 mg/L的硝酸鎂作為基體改進劑，放入石墨爐原子吸收光譜儀測定血清中鉻的含量。該方法樣品不需進行復雜的化學前處理即可測定，克服了生物樣品背景吸收過大的缺點，減少了污染，簡化了操作過程，降低了誤差，大大縮短了分析時間，且質量濃度檢出限低，經方法學研究和對若干份混合血清樣品測定，均取得了滿意的結果。

二、生物樣品中有機化學毒物快速鑒定技術研究

1.帶捕集阱頂空-氣相色譜法技術（FID）應用研究。采用正交設計方法，以四氯乙烯為研究對象，探討用捕集阱頂空-氣相色譜法測定氯代烴的最佳條件，包括測定氯代烴時所采用的溫度、時間、壓強等檢測條件，并對這些條件進行優(yōu)化，得到了使用頂空儀器的最佳條件：取樣針溫度100℃，傳輸線溫度100℃，爐溫80℃，保溫時間30.0 min，干吹時間2.5 min，捕集阱保持時間6.0 min，解析時間1.1 min，加壓時間1 min，釋壓時間0.8 min，色譜柱壓強275.79 kPa，瓶壓強206.84 kPa，解吸壓強103.42 kPa。所得最佳條件可應用于生物樣品中氯代烴的測定。

2.帶捕集阱頂空-氣相色譜法測定血液中四氯乙烯的含量。用5 mL肝素鈉真空抗凝管采集靜脈血5 mL，搖勻，抽取2 mL肝素鈉抗凝全血于頂空樣品瓶中，注入3 mL的蒸餾水，立即密封好頂空瓶口，進行測定。用帶捕集阱頂空儀進樣，經氣相色譜儀（Elite-5MS毛細管柱）分離后使用氫火焰離子化檢測器檢測，峰形分離較為理想。溫度超過70℃時，血液會凝固，因此頂空儀爐溫設為65℃，以減少傳統(tǒng)分析方法中對血液的復雜前處理，保證結果的準確性。該方法操作簡便，靈敏度高，可對高濃度四氯乙烯接觸者的血液中四氯乙烯的濃度進行檢測。

3.帶捕集阱頂空-氣相色譜電子捕獲（ECD）法測定血液中四氯乙烯的含量。樣品經帶捕集阱頂空儀前處理后進入氣相色譜儀，經Elite-1701毛細管柱分離后使用電子捕獲檢測器測定四氯乙烯含量。該方法不僅降低了血液中碳氫有機物質的干擾，而且提高了靈敏度，ECD檢測器信號強度比FID檢測器提高了大約30倍，校準曲線線性范圍為0～160 μg/L，線性相關系數(shù)為0.999 9，質量濃度檢出限達到0.9 μg/L，對高、中、低濃度樣品進行測定，精密度值的相對標準偏差分別為2.15%，4.46%，4.77%，回收率為90%～110%。該方法適用于對低濃度四氯乙烯接觸者以及正常人群血液中四氯乙烯濃度的檢測，而且操作方便，適宜于做大批樣本的測定。

4.帶捕集阱頂空-氣相色譜法測定血液中揮發(fā)性氯代烴的含量。該方法以三氯乙烯為研究對象，探討三氯乙烯測定條件和方法的線性關系、質量濃度檢出限、回收率及穩(wěn)定性。校準曲線線性范圍為0～80μg/L，線性相關系數(shù)為0.999 2，質量濃度檢出限為0.5 μg/L。在線性范圍內，分別對高、中、低濃度樣品進行測定，精密度值的相對標準偏差分別為4.05%，7.28%，7.44%，回收率為96.83%～105.00%。該方法同時可用于血液中三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烯和四氯乙烯等揮發(fā)性氯代烴的測定。

5.血清中毒鼠強含量的快速化學檢測方法研究。以硫酸為分解劑，變色酸為顯色劑，測定血清中的微量毒鼠強。該方法靈敏度高，質量濃度檢測下限達到0.1 mg/L，檢測成本低，實用性強，實驗操作簡便、快捷。

6.分光光度法快速測定尿液中百草枯的含量。先以酸沉淀法或濾紙過濾法消除蛋白質的干擾，再通過百草枯與連二亞硫酸鈉反應生成的有色物質來定性。定量檢測常用方法有兩種。

（1）方法一。用塑料試管取尿液4 mL，加入物質的量濃度為1 mol/L的HCl溶液酸化，搖勻，離心分離15 min（離心機轉速為3 500 r/min）后，取上層清液2.5 mL加人另一個塑料試管，加入0.5 mL物質的量濃度為1 mol/L NaOH溶液，然后加入2 mLNH4C1-NH3溶液（pH=10.3），最后加入4滴質量分數(shù)為10%的連二亞硫酸鈉，倒入比色皿比色，比色時吸收波長為395 nm。通過工作曲線紫外光度法來定量，獲得了滿意的結果。

（2）方法二。取2.5 mL樣品，加入2.5 mL水、0.3 g無水碳酸鈉和0.1 g碳酸氫鈉，搖勻，用慢速定量濾紙過濾，濾液倒入比色皿比色，比色時吸收波長為396 nm，所得吸光度為尿樣的空白吸光度A0；將比色皿中的溶液倒回原試管中，加入0.05 g連二亞硫酸鈉，搖勻，再于396 nm比色，所得吸光度為樣品吸光度A樣0（即A樣-A0），通過線性回歸方程計算得到的值乘以2即為尿中百草枯的濃度。

三、全自動微量元素分析儀

筆者所在項目組研發(fā)的全自動微量元素分析儀以電化學原理為測定依據(jù)，將測試杯轉盤裝置中的轉盤安裝在機架上并通過傳動機構與轉盤電機連接，轉盤在垂直平面內轉動，其圓周體壁均勻安裝一定數(shù)量的固定套，每一個固定套中安裝一個測試杯，二者為轉動配合，并在測試杯下部套裝固定齒輪，該齒輪和測試杯轉動電機的齒輪相連接。自動微量元素分析儀包含測試杯轉盤裝置、電極裝置、樣品盤、自動加樣裝置、底液或活化液加液裝置、清洗裝置及計算機控制裝置。該發(fā)明使用電子技術控制分析儀，各個機械裝置自動運轉，具有自動加樣、自動加活化液、自動測量、自動記錄、自動清洗測試杯和自動干燥測試杯等功能，檢測過程實現(xiàn)了自動化，并且具有設計新穎、測量精度高等優(yōu)點。

本文，筆者所研究的各種方法和技術不但適用于職業(yè)中毒或自殺投毒等中毒患者的診斷，還可以為化學中毒應急救治提供依據(jù)，也可以用于職業(yè)人群的健康體檢。所研發(fā)的全自動微量元素分析儀可以廣泛應用于水質分析、環(huán)境監(jiān)測、臨床檢驗、保健普查、疾病控制等領域，如環(huán)保部門對廢水、廢氣、廢物中的微量元素的監(jiān)測，衛(wèi)生部門對生物材料、生活用品、飲用水、食品等物質中微量元素的檢測等。

河南省科技攻關計劃資助項目（0124170401）。