郭廣君，呂素芳，畢研麗，肖躍強，沈志強*，丁 壯

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062；3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Us3基因編碼絲/蘇蛋白激酶(Us3PK)[1]。最近研究表明Us3PK與介導(dǎo)病毒抗宿主細胞凋亡關(guān)系密切，Us3PK誘導(dǎo)的宿主細胞形態(tài)學(xué)變化與病毒在細胞間的傳播能力密切相關(guān)。近年來還發(fā)現(xiàn)Us3PK通過磷酸化細胞內(nèi)效應(yīng)蛋白調(diào)控病毒自身的復(fù)制，影響病毒核衣殼的包裹，干擾MHC I抗原呈遞途徑等[2]，本文主要介紹Us3PK在病毒侵染細胞動力學(xué)中的作用，綜述Us3PK在病毒與宿主細胞互作中的功能研究進展。

PRV的Us3基因?qū)儆诓《驹鲋车姆潜匦杌?，也是重要的毒力基因。Us3基因的開放閱讀框的核苷酸長度為1002 bp～1170 bp，編碼334～390個氨基酸的Us3PK，該蛋白在皰疹病毒家族中高度保守[3]。具有自磷酸化活性，pH9.0～9.5時酶活性最高，而且酶活性區(qū)域傾向于結(jié)合富含堿性氨基酸殘基的底物，多種PRV蛋白和宿主蛋白如 UL34、Bad及 Bid等為 Us3PK的底物。PRV Us3PK的主要功能為：①在病毒侵染宿主細胞過程中與病毒毒力相關(guān)；②介導(dǎo)細胞形態(tài)和亞細胞結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細胞骨架肌動蛋白應(yīng)力纖維解聚；③引起細胞核內(nèi)效應(yīng)蛋白的磷酸化，調(diào)控病毒自身的復(fù)制速率；④影響病毒核衣殼的包裹；⑤參與識別不同細胞類型，調(diào)節(jié)抗原遞呈復(fù)合物MHC I遞呈抗原。

1 Us3PK在病毒侵染宿主細胞過程中與病毒毒力相關(guān)

Olsen等采用一個隔離培養(yǎng)體系，通過從神經(jīng)元到PK15細胞及軸突介導(dǎo)的PRV感染蔓延，研究了Us3PK對嚙齒類動物毒力強弱和病毒侵染過程中的定位[4]。在Us3基因缺失的情況下，突變株比野生型病毒毒力降低約10倍；在PRV侵染嚙齒類動物眼組織中，Us3基因缺失突變株的毒力略有減弱，Us3基因缺失突變株的毒力表現(xiàn)為遲發(fā)型，但癥狀的嚴重程度隨時間的延長而增加，直到接近野生型病毒。Us3基因缺失突變株也可以造成神經(jīng)損傷，在支配眼組織的傳出和傳入神經(jīng)傳導(dǎo)路中蔓延。但在體外培養(yǎng)的軸突周圍神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)元的病毒定位沒有明顯的區(qū)別。

2 Us3PK介導(dǎo)的PRV抗宿主細胞凋亡

PRV在宿主細胞內(nèi)長期潛伏感染與其反復(fù)激發(fā)抗凋亡功能密切相關(guān)。細胞凋亡主要由內(nèi)外兩條途徑啟動，單純皰疹病毒(HSV)Us3PK的抗凋亡活性也與之相關(guān)。

2.1 Us3PK影響細胞凋亡外部途徑相關(guān)因子的活性 在細胞凋亡的外部途徑中，氨基末端激酶(JNK)的活化即可觸發(fā)細胞凋亡的啟動。研究表明，Us3基因的表達可顯著抑制山梨醇誘導(dǎo)的細胞凋亡，Us3PK抑制了山梨醇誘導(dǎo)的JNK磷酸化[5-6]。此外，當Us3PK表達上調(diào)時，JNK上游激酶MKK4/SEK1磷酸化明顯減弱，表明Us3PK抑制了MKK4/SEK1的磷酸化，并還可抑制MKK4/SEK1上游激酶MEKK1的活性，實現(xiàn)外部途徑上游阻斷細胞凋亡。

2.2 Us3PK影響細胞凋亡內(nèi)部途徑相關(guān)因子的活性 在細胞凋亡的內(nèi)部途徑中，Bcl-2家族成員包括Bax、Bid、Bad等多個蛋白是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。Us3PK可阻斷Bad過表達引發(fā)的細胞凋亡，其抗凋亡作用與Bad Ser112及Ser136磷酸化有關(guān)。體外激酶測定表明，Bad確可被Us3PK磷酸化。Cartier等發(fā)現(xiàn)Us3PK可阻斷Bid過表達介導(dǎo)的細胞凋亡，并能夠阻斷Bax過表達誘導(dǎo)的細胞凋亡，這表明Us3PK也可以作用于Bad的下游因子[7]。然而，激酶失活突變PRV株的感染實驗表明不依賴于Us3PK的磷酸化，凋亡途徑依然能夠被阻斷。因此，Us3PK介導(dǎo)病毒抗凋亡是基于其催化活性。而Us3PK催化活性的調(diào)節(jié)在病毒與宿主細胞互作用過程中具體的調(diào)節(jié)方式和調(diào)節(jié)過程還有待于更加深入的研究。

3 引起細胞形態(tài)和亞細胞結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細胞骨架肌動蛋白應(yīng)力纖維解聚

Us3PK可以導(dǎo)致細胞骨架肌動蛋白動力學(xué)改變，如肌動蛋白應(yīng)力纖維的解聚和病毒囊突的形成，這些均與提高病毒擴散的能力有關(guān)。

Broeke等通過轉(zhuǎn)染PAK1-/-和PAK2-/-小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的研究表明，Us3PK通過抑制在Cdc42/Rac1 Rho GTP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的Ap21基因激活蛋白激酶(PAKs)，從而引起Us3PK介導(dǎo)的肌動蛋白的改變[8]。Us3PK介導(dǎo)的應(yīng)力纖維解聚需要PAK2的參與，其介導(dǎo)的病毒囊突的形成主要是PAK1起作用，表明PAK1與PAK2對肌動蛋白細胞骨架組織具有不同生物學(xué)效應(yīng)。采用PAK1-/-和PAK2-/-MEF培養(yǎng)病毒，病毒表現(xiàn)為較低的蔓延速度。因此，Us3PK是通過結(jié)合和磷酸化蛋白激酶A來影響細胞骨架肌動蛋白。Minnebruggen等認為細胞骨架有利于病毒的復(fù)制和傳播，PRV經(jīng)豬腎臟細胞(SK-6)培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)SK-6肌動蛋白壓力纖維分解。在其研究中，采用不同的PRV缺失突變體感染不同的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Us3PK在不同的PRV缺失株感染的細胞系中參與肌動蛋白應(yīng)力纖維的解聚。此外，通過轉(zhuǎn)染實驗還表明在缺少PRV其他蛋白的情況下，大量的PRV Us3PK定位于核內(nèi)，并能夠觸發(fā)肌動蛋白纖維的解聚[9]。Broeke等發(fā)現(xiàn)Us3PK在病毒侵染中的作用包括調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架，抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)病毒顆粒從核孔釋放[10]。但對Us3PK發(fā)揮其功能的機制仍然知之甚少。最近，他們確定了A p21基因激活激酶PAK1和PAK2在Us3PK的介導(dǎo)的細胞骨架重排的重要效應(yīng)。PAKs與Us3PK的抗凋亡特性有關(guān)[11]。采用野毒和Us3缺失PRV毒株感染野生型MEF、PAK1-/-MEF和PAK2(-/-)MEF顯示，PAK2在感染過程中在Us3PK介導(dǎo)的抑制細胞凋亡過程沒有任何作用，而PAK1卻起到一定的作用。這些結(jié)果表明，PAK1在Us3PK的抗凋亡活性中發(fā)揮了顯著而有限的作用。

4 引起細胞核內(nèi)效應(yīng)蛋白的磷酸化，調(diào)控病毒自身的復(fù)制速率

Erazo等發(fā)現(xiàn)HSVⅠ型(HSV-Ⅰ)、PRV和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)ORF66激酶與Us3PK影響到一些病毒與宿主細胞的相互作用。他們通過HSV-1的Us3PK的基序與細胞中蛋白激酶A(PKA)的重疊促使一種PKA的抗體底物磷酸化，以此確定 Us3PK/ORF66激酶作用靶標[12]。HSV、VZV和PRV促進不同的Us3 PK/ORF66激酶依賴。VZV的Us3PK主要磷酸化125 ku蛋白被確定為核基質(zhì)蛋白3(主要的核基質(zhì)蛋白之一)。核基質(zhì)蛋白3也是一個Us3PK的磷酸化激酶依賴性激酶。核基質(zhì)蛋白3可以被HSV、PRV的Us3PK和VZV的ORF66激酶所磷酸化，由于VZV直接磷酸化效應(yīng)蛋白T150沒有被PKA抑制劑所阻斷，也沒有因PKA的活化而誘導(dǎo)，PKA主要磷酸化核基質(zhì)蛋白3的S188位點，這表明VZV磷酸化效應(yīng)蛋白T150是非依賴PKA的。然而，純化的VZA ORF66激酶在體外沒有磷酸化核基質(zhì)蛋白3的活性，這意味著其磷酸化過程需要更多的細胞因子輔助[13-14]。在缺失ORF66激酶的VZV感染細胞中，核基質(zhì)蛋白3顯示細胞核內(nèi)的變化，在缺失Us3PK的HSV-1或PRV感染的晚期細胞的細胞質(zhì)中核基質(zhì)蛋白3顯示分布明顯發(fā)生變化。這項研究表明，核基質(zhì)蛋白3的磷酸化是這一類磷酸激酶的潛在靶點。Walters等通過轉(zhuǎn)染表達Us3PK的重組質(zhì)粒或HSV-1、VZV和PRV病毒都會引起組蛋白去乙?；?(HDAC2)的磷酸化，并且每個Us3PK磷酸化位點位于HDAC2相對保守的C端絲氨酸殘基上[15-16]。在缺失Us3PK的PRV感染的細胞中HDAC2也過度磷酸化，這表明由PRV引起的HDAC2過度磷酸化與不依賴Us3PK磷酸化的的方式進行。利用特定化學(xué)抑制劑抑制HDAC1活性可以增加缺失了Us3PK的VZV和PRV的蝕斑數(shù)目，而對野毒的蝕斑數(shù)目影響不大，表明VZV和PRV Us3PK的靶標為組蛋白去乙?；?，以減少病毒基因組的沉默并進行高效率的病毒復(fù)制。然而，在HSV-1中沒有這一現(xiàn)象發(fā)生，表明盡管HDAC2是HSV Us3PK磷酸化靶標，其磷酸化與否由其病毒的特異性決定。Deruelle等研究發(fā)現(xiàn)雖然在缺失Us3PK的情況下PRV和HSV侵染一些細胞系造成病毒滴度的降低并延遲了細胞的凋亡，但在豬睪丸細胞和人喉上皮細胞分別培養(yǎng)的缺失Us3PK的PRV和HSV或兩者野毒，利用細胞凋亡蛋白酶阻斷劑阻斷細胞凋亡途徑，并不能影響病毒的出膜和病毒滴度[17]。Skiba等利用缺失Us3的PRV和野毒感染牛腎細胞，然后分離亞細胞組份細胞核和細胞質(zhì)，通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析蛋白質(zhì)表達水平，結(jié)果表明有兩個55 ku蛋白表達水平明顯增高，其中磷酸化修飾在蛋白表達調(diào)控中起到重要作用，能夠明顯增加主要的DNA結(jié)合蛋白(UL29)和核糖核苷酸還原酶大亞基(UL39)的表達水平，降低DNA聚合酶促進因子(UL42)的表達水平[18]。Poon等發(fā)現(xiàn)Us3PK通過磷酸化作用阻止組蛋白的去乙?；?，調(diào)控基因的表達[19]。

5 影響病毒核衣殼的包裹

PRV最初的被膜由核膜內(nèi)部小葉捕獲并通過核膜外運小葉轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，而缺失Us3PK會導(dǎo)致后一過程受到影響[20-21]。釋放到細胞質(zhì)中的包膜和病毒衣殼蛋白穿過高爾基體囊泡，釋放成熟的具有感染性的病毒粒子，并通過轉(zhuǎn)運小體釋放到質(zhì)膜外[22]。在形成最初病毒體的階段，在PRV、HSV-1和鼠科巨細胞病毒中UL31和UL34蛋白起著重要作用[23-26]。而在缺失Us3PK的情況下，病毒核衣殼初始物會聚集在核膜周圍，核衣殼的進一步包裹和成熟受到影響[27-29]。盡管Us3PK可以磷酸化UL34蛋白，但其磷酸化水平并沒有因為Us3PK的缺失而有所改變[30-31]。

6 干擾MHC I抗原呈遞途徑

許多皰疹病毒通過影響MHC I抗原呈遞途徑來減少細胞毒性T細胞的清除作用，在最大的單皰疹病毒亞科中，兩種高度同源蛋白抑制MHC I細胞表面抗原的表達：牛皰疹病毒 1型(BoHV-1)、PRV、EHV-1 UL49.5蛋白和VZV Us3PK。PRV降低MHC I細胞表面抗原的表達依賴于感染細胞的類型[32]。在ST細胞中，Us3PK表現(xiàn)其酶活性但不影響MHC I細胞表面抗原，而在PK-15和肺泡巨噬細胞Us3PK的酶學(xué)活性不是必需的，在PK-15細胞中依賴UL49.5。研究表明由PRV介導(dǎo)的MHC I細胞表面抗原的改變依賴于細胞類型，并且Us3PK和UL49.5蛋白可能與未知的早期病毒調(diào)控蛋白在這一過程中起到重要作用。

7 結(jié)束語

Us3基因為PRV的非結(jié)構(gòu)基因，其編碼產(chǎn)物Us3PK具有多功能性，與病毒侵染過程中抗細胞凋亡及病毒衣殼蛋白的包裝及在細胞間擴散傳播密切相關(guān)，介導(dǎo)細胞形態(tài)和亞細胞結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細胞骨架肌動蛋白應(yīng)力纖維解聚，引起細胞核內(nèi)效應(yīng)蛋白的磷酸化，調(diào)控病毒自身的復(fù)制速率，干擾MHC I抗原呈遞途徑等。進一步研究PRV Us3基因的功能及作用機制，這些研究結(jié)果為闡明PRV及相關(guān)皰疹病毒侵染細胞動力學(xué)或凈化該類病毒提供相應(yīng)的實驗依據(jù)。

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