張超林，劉春國(guó)，王壽山，石薇琳，李建輝，王 偉，劉彥云，劉 明*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

H5N1亞型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是引起禽流感暴發(fā)的主要病原，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。流感病毒粒子表面具有囊膜，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是病毒囊膜上的兩種主要抗原，可以誘導(dǎo)禽類和哺乳動(dòng)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)[1]。疫苗免疫是預(yù)防AIV感染的主要措施，目前使用的禽流感疫苗主要為傳統(tǒng)的全病毒滅活疫苗及重組活載體疫苗[2-3]。

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是新型流感疫苗研究的一種策略，與傳統(tǒng)禽流感疫苗生產(chǎn)方法相比，該疫苗不依賴于傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)系統(tǒng)，而采用體外細(xì)胞培養(yǎng)制備疫苗抗原；因其不含有病毒的基因組，因此具有更高的安全性；而且制備的VLPs與病毒粒子的天然構(gòu)象相同或相似，有利于將表面糖蛋白呈遞給免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[3]。本實(shí)驗(yàn)采用構(gòu)建同時(shí)表達(dá)多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)VLPs形成的影響進(jìn)行探索，并進(jìn)一步鑒定了流感VLPs的免疫原性和生物學(xué)活性，為研制新型流感亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒和菌株 含有流感病毒A/Goose/QFY/2004(H5N1)HA基因和A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)M1基因重組質(zhì)粒pHWQFY-HA和pHWPR-M1均由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual和pFastBac1，Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α和DH10Bac由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 ExTaq酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和小量膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN生物技術(shù)公司；胎牛血清和Cell Fectin轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染蛋白分子量購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化所；雞抗H5N1亞型AIV的血清，鼠抗H5N1亞型AIV HA單克隆抗體(MAb)97D2均由哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感實(shí)驗(yàn)室制備；堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG(IgG-AP)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；紅外熒光標(biāo)記羊抗雞IgY(IgY-FITC)購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；AP標(biāo)記羊抗雞IgG(IgG-AP)購(gòu)自Sigma公司。

1.3 PCR用引物設(shè)計(jì)和目的基因的擴(kuò)增 參考GenBank已發(fā)表中國(guó)大陸地區(qū)H5N1亞型AIV基因序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)HA和M1基因的特異性引物(表1)，擴(kuò)增HA、M1片段分別為1700 bp和800 bp。PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s、52℃30 s、72℃2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。參考pFastBac Dual載體設(shè)計(jì)測(cè)序用引物pFastBac-F和pFastBac-R(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)中PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCR amplification in the experiment

1.4 穿梭載體pFastBacDual-HA-M1和pFastBacl-HA的構(gòu)建 分別以pHWQFY-HA和pHWPR-M1為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增HA和M1片段。用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增的片段和載體酶切處理，將HA片段分別與pFastBacDual和pFastBac1連接，獲得重組質(zhì)粒pFastBacDual-HA和pFastBac1-HA；用SalⅠ和NotⅠ對(duì)pFastBacDual-HA和M1片段酶切處理，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacDual-HA-M1(圖1)。提取、鑒定重組質(zhì)粒，并由南京金斯瑞科技有限公司測(cè)序。

圖1 流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)構(gòu)建模式圖Fig.1 Constructs for expression of influenza proteins

1.5 重組桿粒的構(gòu)建 按照Invitrogen公司的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明將pFastBacDual-HA-M1和pFastBac1-HA分別轉(zhuǎn)化E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，提取重組桿粒，并進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的重組桿粒分別命名為rBacmid-HA-M1和rBacmid-HA。

1.6 重組桿狀病毒的制備 按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書進(jìn)行。分別取2 μg rBacmid-HAM1和rBacmid-HA，在Cellfectin的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27℃培養(yǎng)4 d～5 d，觀察細(xì)胞病變(CPE)，收集上清作為第一代重組病毒(P1)，以終點(diǎn)稀釋法確定重組桿狀病毒原液的滴度，將重組病毒分別命名為rBV-HA-M1和rBV-HA。

1.7 重組蛋白的表達(dá)及鑒定

1.7.1 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè) 將高滴度的rBV-HA-M1和rBV-HA分別接種Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，感染72 h后收集樣品細(xì)胞，以12%SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白表達(dá)情況。

1.7.2 重組蛋白的western blot鑒定 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，以雞抗H5N1亞型AIV的陽(yáng)性血清為一抗(1∶250)，以羊抗雞IgY-FITC為二抗(1∶2500)，用紅外熒光掃描儀成像。

1.7.3 VLPs的電鏡觀察 將P3代rBV-HA-M1和rBV-HA分別感染Sf9細(xì)胞，按常規(guī)方法收集處理樣品，進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染，采用透射電鏡觀察VLPs。

1.7.4 重組蛋白血凝滴度的測(cè)定 按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)血凝檢測(cè)方法，在96孔血凝板中用1%的雞紅細(xì)胞懸液檢測(cè)。室溫作用30 min后，以孔內(nèi)凝集紅細(xì)胞不下流為終點(diǎn)，將該孔的稀釋度表示為血凝滴度。

1.7.5 免疫組織化學(xué)法的鑒定 將P3代rBV-HAM1和rBV-HA分別以1 MOI接種于24孔板中的Sf9單層細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，采用3%福爾馬林固定細(xì)胞，作用20 min；浸透液(3%福爾馬林和0.5%Triton-100)作用10 min；以鼠抗H5亞型AIV HA的MAb為一抗(1∶1000)，以馬抗鼠 IgG-AP 為二抗(1∶2500)，用顯色液顯色(NBT/BCIP)，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體和重組桿粒的鑒定 將構(gòu)建的pFastBacDua-HA-M1重組質(zhì)粒分別用AscⅠ單酶切或XhoⅠ和NheⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析表明分別切下大小約為2300 bp和800 bp的條帶；構(gòu)建的pFastBac1-HA重組質(zhì)粒用AscⅠ單酶切也可獲得約為2300 bp的條帶；用M13通用引物對(duì)重組桿粒PCR鑒定，擴(kuò)增rBacmid-HA-M1和rBacmid-HA分別可以得到約為5100 bp和4300 bp的特異性條帶，而陰性對(duì)照只擴(kuò)增得到約為300 bp大小的條帶，與理論值相符(圖2)。

2.2 重組桿狀病毒的制備 將構(gòu)建的重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒rBv-HA-M1和rBV-HA。其病毒效價(jià)檢測(cè)，P3代病毒的TCID50分別為3.16×107/mL和 3.07×107/mL。

圖2 重組桿粒PCR鑒定及穿梭重組桿質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant Bacmid by PCR

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE和western blot鑒定重組病毒感染Sf9細(xì)胞裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳，顯示在70 ku和26 ku處出現(xiàn)了特異性條帶。用鼠抗H5N1 AIV的血清對(duì)重組蛋白進(jìn)行western blot鑒定，在70 ku和26 ku處可見(jiàn)特異性條帶(圖3)。

圖3 SDS-PAGE和western blot檢測(cè)重組蛋白Fig.3 The SDS-PAGE and western blot analysis of the recombinant protein expressed in Sf9

2.4 VLPs的電鏡觀察 將獲得的重組蛋白用透射電子顯微鏡觀察，rBV-HA-M1表達(dá)的重組蛋白在電鏡下可以觀察到表面具有纖突的囊膜狀VLPs(圖4A)，而單獨(dú)表達(dá)HA蛋白沒(méi)有觀察到VLPs(圖4C)。

圖4 透射電鏡觀察重組蛋白(Bar=100 nm)Fig.4 Morphologic observation of VLP and virus particals under transmission electron microscope

2.5 重組蛋白的免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，可以觀察到被病毒感染的細(xì)胞中AIV的HA和M1蛋白獲得了有效表達(dá)，呈現(xiàn)紫色(圖5)。

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)重組蛋白Fig.5 Immunohistochemical detection of the recombinant protein

2.6 重組蛋白的血凝滴度測(cè)定 將rBV-HA-M1和rBV-HA分別以10 MOI感染Sf9細(xì)胞，72 h后細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，收集上清進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示rBV-HA和rBV-HA-M1表達(dá)的重組蛋白的血凝價(jià)分別為 1∶27和 1∶28。

3 討論

目前，流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1及H9N2等亞型中均有關(guān)于VLPs的報(bào)道[4-9]。研究顯示VLPs能夠有效的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[4,6]，誘導(dǎo)抗HA抗體的能力與弱毒疫苗相似或更高[5]。Quan等研究顯示H1N1 VLPs免疫小鼠能夠抵抗同源和異源流感病毒的攻擊。一系列研究表明流感VLPs是替代現(xiàn)有疫苗的最佳候選者[7]。

本研究通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)AIV結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)果顯示單獨(dú)表達(dá)HA蛋白或共表達(dá)HA和M1蛋白均具有較高的血凝活性，表明通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞獲得的HA蛋白具有天然活性。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)的HA和M1蛋白可以明顯的觀察到流感VLPs的存在；張樹(shù)梅等研究表明將HA，NA和M1基因構(gòu)建在于不同的啟動(dòng)子之下在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)，在透射電子顯微鏡可以觀察到VLPs[8]，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。Gary等的研究顯示單獨(dú)表達(dá)HA蛋白可以形成VLPs[9]，而本研究的結(jié)果卻與之相反。

HA含有流感病毒的重要抗原表位，在疫苗的生產(chǎn)中，高滴度的HA特異性抗體是流感疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免疫的關(guān)鍵[9-11]，張曉霽等的研究也顯示AIV HA是激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要蛋白[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，將HA基因插入PPH啟動(dòng)子之下，將M1基因插入P10啟動(dòng)子之下，其表達(dá)的HA蛋白比M1蛋白所占的比例高，表明在VLPs形成中，可以根據(jù)不同蛋白的比例選擇不同的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)的重組蛋白能夠與鼠抗H5N1亞型AIV血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明通過(guò)該方法制備的禽流感VLPs具有良好的生物學(xué)活性，該方法為流感病毒的生物學(xué)特性研究提供了有力的工具，同時(shí)這種制備VLPs的方法在AIV亞單位疫苗的研制中有著良好的應(yīng)用前景。

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