常曉飛，趙雙成，田 石，柳金雄，王靖飛，曾顯營，胡永浩，姜永萍*，陳化蘭*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730007；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所疫病診斷與技術(shù)服務(wù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza)是由A型流感病毒(AIV)引起的使患病禽類表現(xiàn)嚴重的呼吸困難、產(chǎn)蛋力降低及隱性感染的一種禽類常見疾病[1]。其中H5亞型高致病性AIV由于具有致死率高的特點，對養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的威脅[2-4]。

血凝素蛋白(HA)是構(gòu)成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一，研究表明，HA參與流感病毒和宿主細胞的吸附過程，HA蛋白的裂解也與流感致病性有關(guān)[5]，抗HA的抗體可以中和病毒的感染力。近年來研究表明基于HA蛋白的基因工程疫苗具有良好的免疫效力[6-9]。為研究表達AIV同義HA基因編碼蛋白對H5亞型不同抗原群AIV的交叉保護，我們構(gòu)建表達H5亞型同義HA基因(Cons-HA5)的重組表達質(zhì)粒pCACons-HA5，對該真核重組表達質(zhì)粒在不同時間段的表達情況進行了研究，以期為進一步對pCACons-HA5的免疫效力的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、細胞及質(zhì)粒 大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞購自北京莊盟生物公司；293T細胞以及真核表達質(zhì)粒pCAGGS由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 DNA分子量Marker，rTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶以及連接酶購自于NEB公司；DNA膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自于OMEGA公司；組織細胞裂解液、FITC標記兔抗雞IgG(FITC-IgG)及HRP標記羊抗雞IgG(HRP-IgG)均購自Solarbio公司；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司；H5亞型AIV多克隆抗體由哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點實驗室保存。激光共聚焦顯微鏡(TCS，SP5)為德國Leica產(chǎn)品。

1.3 同義H5亞型AIV的HA氨基酸序列及分析根據(jù)NCBI流感數(shù)據(jù)庫中5000條H5亞型AIV的HA全長氨基酸序列，采用Clustal W1.8.3進行多序列比對及分析，按70%的同源性為標準獲得一條同義氨基酸序列，并命名為Cons-HA5，將其相應(yīng)的核苷酸序列的密碼子優(yōu)化為雞體偏嗜的密碼子，通過人工合成獲得一個H5亞型同義Cons-HA5基因，優(yōu)化后的Cons-HA5基因由金斯瑞生物公司合成。

1.4 pCACons-HA5真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將合成的Cons-HA5基因定向克隆于真核表達載體pCAGGS的EcoRⅠ和SmaⅠ位點，構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pCACons-HA5用酶切和PCR鑒定其正確性。

1.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后不同時間Cons-HA蛋白在293T細胞的表達 根據(jù)LipofectamineTM2000操作說明書的方法將pCACons-HA5轉(zhuǎn)染到293T細胞，分別在轉(zhuǎn)染后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、16 h、24 h、32 h和48 h用4%的多聚甲醛溶液在室溫下對細胞固定1 h，用5%的BSA封閉1 h；以H5亞型陽性血清為一抗(1∶500)；避光條件下加入用1%BSA稀釋的兔抗雞IFTC-IgG二抗(1∶2000)，采用50 mg/mL的DAPI避光條件下37℃作用15 min進行細胞核染色；將不同時段的轉(zhuǎn)染細胞置于激發(fā)光為λ488nm的共聚焦激光顯微鏡下進行觀察。

1.6 pCACons-HA5表達蛋白的western blot鑒定將轉(zhuǎn)染pCACons-HA5的293T細胞，分別在轉(zhuǎn)染后24 h和48 h收集細胞，經(jīng)組織/細胞裂解液和超聲波進行裂解。2500 r/min離心10 min，取上清進行12%SDS-PAGE凝膠分離隨后進行轉(zhuǎn)膜處理1 h，用5%的脫脂乳對NC膜進行封閉處理。以抗AIV多克隆抗體為一抗(1∶300)以羊抗雞HRP-IgG為二抗(1∶5000)，采用DAB顯色液進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 pCACons-HA5的構(gòu)建 將人工合成的cons-HA5基因克隆于pCAGGS真核表達載體中，將重組質(zhì)粒pCACons-HA5經(jīng)EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到約為1700 bp和4700 bp的兩個條帶，經(jīng)ScaⅠ單酶切處理后得到了約為6400 bp的一個條帶；用特異性引物進行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見約1700 bp的特異性片段(圖1)，與預(yù)期值相符。

圖1 質(zhì)粒pCACons-HA5的酶切分析和PCR鑒定Fig.1 Identification of pCACons-HA5 by restriction enzyme digestions and PCR amplification

2.2 pCACons-HA5表達蛋白在細胞內(nèi)的定位 通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察pCACons-HA5轉(zhuǎn)染到293T 細胞 2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h后Cons-HA5在細胞的表達及分布情況。在轉(zhuǎn)染pCACons-HA5后2 h在細胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光分布，4 h后在細胞質(zhì)及細胞膜處可見綠色熒光分布，6 h后在細胞膜處可見較明顯的綠色熒光分布，直至轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h在細胞膜處可見十分明顯的綠色熒光分布(圖2)。

2.3 Western blot鑒定結(jié)果 Western blot檢測結(jié)果表明，pCACons-HA5轉(zhuǎn)染293T細胞后24 h和48 h，在70 ku處均出現(xiàn)明顯條帶。Western blot檢測到Cons-HA5蛋白在293T細胞中獲得表達(圖3)。

3 討論

AIV的HA蛋白在病毒侵入細胞的過程中起著重要的作用，并且是AIV最主要的保護性抗原[10]。由于HA基因的高突變率，在一定條件下有發(fā)生疫苗株與主要流行病毒株不完全匹配的可能性。本研究經(jīng)多條H5亞型AIV的HA氨基酸序列進行比對分析，得到一條同義HA蛋白序列Cons-HA5，構(gòu)建出重組表達載體pCACons-HA5，以期為有效防控不同抗原群的H5亞型禽流感提供一定的思路。

圖2 Cons-HA5蛋白在293T細胞中的定位Fig.2 Localization of protein of Cons-HA5 in 293T cells

圖3 Cons-HA5蛋白的western blot分析Fig.3 Identification of the Cons-HA5 expression by western blot

本研究通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察pCACons-HA5轉(zhuǎn)染到293T細胞不同時間段后Cons-HA5蛋白在細胞的表達及分布情況。當重組質(zhì)粒pCACons-HA5轉(zhuǎn)染于真核細胞后2 h開始在細胞質(zhì)內(nèi)表達，當轉(zhuǎn)染4 h后蛋白就已在膜表面開始表達，并隨著轉(zhuǎn)染時間的推移，該蛋白在膜表面表達的量也就越來越明顯，同時研究表明流感病毒在感染宿主細胞后HA蛋白就可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，合成后向高爾基體運輸，最后通過高爾基體到達細胞表面。這一合成并轉(zhuǎn)移的過程在流感病毒感染細胞后2 h～4 h內(nèi)發(fā)生[11-12]，在病毒感染宿主細胞后2 h～4 h便可以檢測到有HA蛋白在宿主細胞膜上的表達，這一時間正與pCACons-HA5在293T細胞中開始合成與表達的時間相吻合。由此表明pCACons-HA5轉(zhuǎn)染真核細胞后蛋白的合成、轉(zhuǎn)移及表達情況與流感病毒相類似。但關(guān)于該重組質(zhì)粒作為疫苗使用的免疫效力及免疫該重組質(zhì)粒后使機體能夠產(chǎn)生有效免疫力的最短時間的判定等一系列問題仍需要進一步研究。

總之，本研究構(gòu)建了表達H5亞型同義HA蛋白的重組表達質(zhì)粒pCACons-HA5，并通過觀察其在293T細胞中的表達定位以及所表達的Cons-HA5蛋白的western blot驗證，表明pCACons-HA5具有相關(guān)的生物反應(yīng)活性，為進一步的免疫效力研究奠定了基礎(chǔ)。

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