李 正，程相朝，張春杰，李銀聚，李 靜，張明亮，田芳華，楊寧寧

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

鼠傷寒沙門氏菌(Salminella typhimurium)是一種腸道致病菌，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，常因伴發(fā)或繼發(fā)感染其它疾病或治療不及時(shí)而發(fā)生大批死亡，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失，同時(shí)又是重要的人類食物源性病原體。由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，該類菌株耐藥性日趨嚴(yán)重以及基于食品安全的考慮，免疫預(yù)防S.typhimurium疾病更為重要，但目前仍沒有能夠很好控制S.typhimurium病的活疫苗，而常規(guī)滅活疫苗不能產(chǎn)生很好的免疫力以抵御野毒的感染[1-2]。

通過基因工程方法減毒的沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物的致病力顯著降低，但仍然保持良好的感染性和免疫原性[3]。目前已有多個(gè)毒力相關(guān)基因被鑒定，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一系列毒力基因突變的減毒沙門氏菌株。編碼環(huán)化腺苷酸合成酶的cya和編碼環(huán)化腺苷酸受體蛋白的crp作為沙門氏菌的毒力調(diào)節(jié)基因研究已很深入，而國內(nèi)尚未見構(gòu)建S.typhimurium crp/cya基因雙缺失株的報(bào)道，均為國外引進(jìn)此類菌株作為載體或疫苗進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建 S.typhimuriumSL1344△cya基因缺失突變株，但其免疫原性還未得到證實(shí)，為探索更加安全和免疫原性良好的減毒株，本研究在SL1344△cya的基礎(chǔ)上，以crp基因作為減毒基因，采用重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的等位基因交換技術(shù)構(gòu)建S.typhimurium SL1344△crp△cya雙基因缺失突變株，研究其生物學(xué)特性，進(jìn)而為開發(fā)更加安全有效的S.typhimurium弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件 S.typhimurium SL1344由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)；SL1344△cya、自殺性質(zhì)粒pRE112△crp(oriT oriV△asdCmrSacB)及其宿主菌大腸桿菌 χ7213(Thi-1 thr-1 leuB6 fhuA21 lacY1 glnV44△asdA4 recA1 RP42-Tc∷ Mu[λpir]Kmr)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。各培養(yǎng)基根據(jù)需要加入終濃度為25μg/mL的氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、100μg/mL的氨芐青霉素(Amplicillin，Amp)、50μg/mL的二氨基庚二酸(D L-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 各種生化鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門氏菌屬診斷血清(11種)及各種單因子血清購自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司；DAP、蔗糖購自美國Sigma-Aldrich公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、pMD18-T、T4 DNA Ligase和限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；麥康凱瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基購自英國OXOID公司。常規(guī)方法檢測(cè)沙門氏菌陰性的1日齡健康羅曼雛公雞，購自洛陽公華種雞場(chǎng)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物(表1)。根據(jù)GenBank中已登錄的S.typhimuriumLT2(AE008859)crp基因序列設(shè)計(jì)crp基因相關(guān)引物；根據(jù)S.typhimurium invA基因序列合成特異性引物Pi1/Pi2用于沙門氏菌的擴(kuò)增鑒定。各引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物序列Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.4 S.typhimuriumSL1344株△crp△cya雙缺失株的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)[4]的方法并加以改良，通過重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌基因接合轉(zhuǎn)移的作用，二步法篩選基因缺失突變株。以轉(zhuǎn)化了重組自殺性質(zhì)粒pRE△crp的大腸桿菌 χ7213為供體菌，SL1344△cya為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，供體菌和受體菌菌液各取100 μL混合后加入含有DAP的LB液體培養(yǎng)液1 mL，37℃培養(yǎng)24 h，取500 μL菌液涂布于含Cm的LB固體平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取Cm抗性菌落進(jìn)一步接種于含蔗糖的LB固體平板驗(yàn)證其蔗糖敏感性，再用引物T1/T2擴(kuò)增鑒定Cm抗性蔗糖敏感(Cmr/SUCs)菌。將Cmr/SUCs陽性接合子轉(zhuǎn)接于含5%蔗糖無抗性無NaCl的LB(NB)低營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，連續(xù)10倍稀釋，選取合適的稀釋度涂布于含5%蔗糖的NB瓊脂固體平板，篩選出Cm敏感蔗糖抗性(Cms/SUCr)的菌落。提取基因組，采用引物T1/T2擴(kuò)增鑒定，陽性缺失株進(jìn)一步用引物T2/T3擴(kuò)增鑒定。

1.5 缺失株SL1344△crp△cya的生物學(xué)特性研究

1.5.1 缺失株SL1344△crp△cya表型鑒定 將SL1344△crp△cya、親本株SL1344△cya與野生型菌株SL1344分別劃線接種于含和不含1%麥芽糖的麥康凱平板上，將細(xì)菌轉(zhuǎn)接葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖等生化鑒定管，并進(jìn)行O和H抗原等相關(guān)血清型鑒定，研究其生化特性。

1.5.2 缺失株SL1344△crp△cya的遺傳穩(wěn)定性將缺失株SL1344△crp△cya接種于LB固體培養(yǎng)基中連續(xù)盲傳 60代，挑取第 10、20、30、40、50、60代單菌落，用引物T3/T2 PCR擴(kuò)增鑒定，以研究crp缺失基因在雙缺失株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.5.3 缺失株SL1344△crp△cya的生長(zhǎng)特性 缺失株SL1344△crp△cya、親本株SL1344△cya與野生株SL134437℃培養(yǎng)過夜，無菌生理鹽水連續(xù)10倍稀釋，取100 μL適當(dāng)稀釋度菌液均勻涂布于平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取平均值推算原液CFU。調(diào)整終濃度約為106cfu/mL后，經(jīng)37℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣平板計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5.4 缺失株SL1344△crp△cya的毒力測(cè)定 缺失株SL1344△crp△cya與野生株SL1344在LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，按1.5.3所述方法平板計(jì)數(shù)推算接種劑量，無菌生理鹽水連續(xù)5倍稀釋或5倍濃縮，選取合適的濃度，每個(gè)濃度500 μL/只口服感染10只1日齡雛雞，觀察直至無雞只死亡，同時(shí)設(shè)生理鹽水、空白對(duì)照。死亡雛雞肝臟無菌接種SS和含有1%麥芽糖的麥康凱瓊脂平板，用引物Pi1/Pi2擴(kuò)增鑒定，統(tǒng)計(jì)死亡情況，根據(jù)Bliss法計(jì)算菌株對(duì)雛雞的半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié)果

2.1 缺失株 SL1344△crp△cya的構(gòu)建及篩選χ7213(pRE△crp)與SL1344△cya接合轉(zhuǎn)移后發(fā)生第一次同源臂間的單交換，用crp一條上臂內(nèi)部引物T1和一條下臂內(nèi)部引物T2擴(kuò)增結(jié)合子，得到約為918 bp和599 bp兩條DNA片段(圖1A)。陽性接合子呈Cm抗性，但同時(shí)對(duì)蔗糖敏感(Cmr/SUCs)。由于自殺性質(zhì)粒pRE△crp被整合到SL1344△cya染色體中，crp則具有兩個(gè)拷貝，出現(xiàn)缺失型和野生型兩條片段。pRE△crp含有負(fù)向選擇基因(sacB蔗糖敏感基因)，陽性接合子在含5%蔗糖無抗性無NaCl的LB(NB)液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)中發(fā)生第二次同源重組，用引物T1/T2擴(kuò)增產(chǎn)生兩種結(jié)果，一種是突變型擴(kuò)增產(chǎn)物為599 bp大小的片段，一種是恢復(fù)野生型大小為918 bp(圖1B)。為了進(jìn)一步證明該同源重組是發(fā)生在SL1344△cya的染色體而不是重組自殺性質(zhì)粒中，用crp一條下臂內(nèi)部引物T2和一條上臂以外染色體上的引物T3擴(kuò)增鑒定陽性缺失株，同樣有兩種結(jié)果，缺失株擴(kuò)增出1412 bp片段，野生型擴(kuò)增出1731 bp片段，而pRE△crp無任何條帶(圖1C)。PCR鑒定結(jié)果表明篩選得到的Cm敏感和蔗糖抗性(Cms/SUCr)缺失株即為SL1344△crp△cya。

圖1 缺失株SL1344△crp△cya株P(guān)CR鑒定Fig.1 Identification of SL1344△crp△cyamutant by PCR

2.2 缺失株SL1344△crp△cya的生物學(xué)特性

2.2.1 缺失株SL1344△crp△cya的表型鑒定 野生株SL1344能夠利用麥芽糖，在含有麥芽糖的麥康凱瓊脂平板上呈紅色菌落。構(gòu)建的雙缺失株SL1344△crp△cya與親本株SL1344△cya保持一致，不能利用麥芽糖，因此在含麥芽糖的麥康凱瓊脂平板上呈無色菌落。進(jìn)一步的生化鑒定結(jié)果表明，雙缺失株與野生株相比，生化特性變化明顯，SL1344△crp△cya失去利用麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等碳源的能力，也不能分解H2S，但保留利用葡萄糖的能力，這些特性均與親本株SL1344△cya一致。SL1344△crp△cya 的血清型為 1，4，5，12∶i∶1，2，同親本株與野生株相同，沒有發(fā)生變化(表2)。

2.2.2 缺失株SL1344△crp△cya的遺傳穩(wěn)定性 將缺失株SL1344△crp△cya在LB固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)60代，應(yīng)用引物T3/T2 PCR擴(kuò)增鑒定第10、20、30、40、50、60代的單菌落，均能得到缺失型的1412 bp的△crp片段，親本株SL1344△cya擴(kuò)增得到野生型的1731 bp的crp片段(圖2)，這表明缺失株SL1344△crp△cya能夠穩(wěn)定遺傳缺失了319 bp的crp基因片段。

表2 缺失株SL1344△crp△cya、親本株SL1344△cya與野生株SL1344在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Table 2 The growth of SL1344△crp△cyamutant,the parent SL1344△cyastrain and the SL1344 on medium

圖2 PCR鑒定缺失株△crpSL1344的穩(wěn)定性Fig.2 Stability identification of of SL1344△crp△cya mutant by PCR

2.2.3 缺失株SL1344△crp△cya的生長(zhǎng)特性 將雙缺失株SL1344△crp△cya、親本株 SL1344△cya及野生株SL1344分別在麥康凱培養(yǎng)基上經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后，平均菌落直徑分別為0.4 mm、0.8 mm和1.7 mm。調(diào)整菌液濃度后，從約106cfu繼續(xù)培養(yǎng)，每1 h取樣，平板計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示雙缺失株SL1344△crp△cya與親本株SL1344△cya生長(zhǎng)速度都明顯慢于野生株SL1344，但SL1344△crp△cya的生長(zhǎng)更為緩慢（圖3）。

2.2.4 缺失株SL1344△crp△cya的毒力測(cè)定 口服感染不同濃度野生株的雛雞，呈現(xiàn)不同程度的死亡；口服感染SL1344△crp△cya的雛雞，各劑量組均未發(fā)生死亡，僅在1010和1011兩個(gè)較高濃度組出現(xiàn)精神欠佳、食欲減退及輕微下痢癥狀。無菌生理鹽水和空白對(duì)照組雛雞均表現(xiàn)正常。死亡雛雞剖檢后均呈現(xiàn)典型的沙門氏菌病變。采集各組死亡雛雞的肝臟無菌接種到SS瓊脂上，取其菌落用引物Pi1/Pi2均能擴(kuò)增出約580 bp的特異性DNA條帶；血清型鑒定結(jié)果表明，分離細(xì)菌的抗原式均為1，4，5，12∶i∶1，2，由此可以證明死亡雛雞是感染S.typhimurium所致。應(yīng)用Bliss法計(jì)算，野生株SL1344的LD50為2.28×105，由此可以推斷缺失株SL1344△crp△cya的毒力較其至少降低了106倍(表3)。

圖3 SL1344△crp△cya、親本株SL1344△cya與野生株SL1344的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curves of SL1344△crp△cya,SL1344△cyaand SL1344

表3 缺失株SL1344△crp△cya和野生株SL1344的毒力測(cè)定Table 3 Mortality of chicks post oral infection with SL1344△crp△cyaor SL1344 strain

3 討論

常規(guī)滅活疫苗產(chǎn)生的保護(hù)水平低且持續(xù)時(shí)間短[5]，近年來通過基因工程方法構(gòu)建減毒沙門氏菌作為口服疫苗及其作為疫苗活載體表達(dá)外源抗原已成為研究熱點(diǎn)[6]。cya和crp基因編碼的蛋白具有多種調(diào)節(jié)功能，包括碳水化合物及氨基酸的利用，細(xì)菌代謝過程中某些基因的轉(zhuǎn)錄，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)送和分解，一些氨基酸滲透酶的合成，鞭毛、菌毛的合成，外膜蛋白的合成以及多種基因表達(dá)等；crp與cya基因的突變勢(shì)必影響菌體的正常代謝速率、生理合成功能及多種基因的表達(dá)等，從而降低毒力，但仍能夠在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[7]。Curtiss用Tn10轉(zhuǎn)座得到含有或不含毒力質(zhì)粒pStSR100的具有鐮孢菌抗性的S.typhimuriumSR-11株的crp與cya突變株，這些突變株對(duì)小鼠無毒性但具有良好的免疫原性[8]。徐引弟等在毒力較弱且免疫原性較好的疫苗弱毒株豬霍亂沙門氏菌C500基礎(chǔ)上構(gòu)建了crp基因缺失突變株，基因缺失后毒力降低約22倍[9]。但有關(guān)S.typhimurium crp/cya基因雙缺失的構(gòu)建國內(nèi)尚未見報(bào)道。覃宗華等從國外引進(jìn)了S.typhimuriumX4550 cya/crp雙突變減毒株，并研究了該菌株對(duì)雞的致病力及其在雞體所誘導(dǎo)的特異性免疫保護(hù)效果，結(jié)果表明S.typhimurium的cya/crp突變株不僅毒力明顯降低，而且保留了良好的免疫原性[10]。

與隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子等傳統(tǒng)的基因工程方法相比，由重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌等位交換進(jìn)行革蘭氏陽性菌和陰性菌染色體上的基因重組或突變具有重組率高、篩選方便等較多優(yōu)點(diǎn)。本研究中使用的自殺性質(zhì)粒pRE112△crp[4]含有正向選擇的氯霉素(Cm)抗性基因和反向選擇的蔗糖敏感基因(sacB)兩種選擇標(biāo)記，明顯提高了重組幾率。但親本株SL1344△cya與SL1344△crp△cya在含麥芽糖的麥康凱培養(yǎng)基上均呈無色菌落，并不易于篩選。通過長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)性的觀察培養(yǎng)及加大篩選量，最終通過PCR鑒定并得出結(jié)果。篩選出的SL1344△crp△cya突變株，通過生物學(xué)特性研究表明其血清型沒有發(fā)生改變，遺傳穩(wěn)定，毒力顯著降低。在本研究中，最高接種劑量也未致雛雞死亡，僅對(duì)其采食和精神狀況有一定影響。根據(jù)結(jié)果可以推測(cè)構(gòu)建的SL1344△crp△cya雙缺失株對(duì)1日齡雛雞的LD50大于1011。如果要準(zhǔn)確測(cè)定其LD50須再提高接種劑量，因此本實(shí)驗(yàn)只是以最高感染劑量對(duì)雞所引起的臨床癥狀作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)所構(gòu)建菌株的致病力。覃宗華等曾對(duì)S.typhimuriumX4550cya/crp雙突變減毒株對(duì)雞的致病力做出研究[11]，這與其報(bào)道結(jié)果幾乎一致。根據(jù)Bliss法算出野生株SL1344的LD50為2.28×105，與其相比，SL1344△crp△cya減毒至少106倍，顯示其具有良好的安全性，為開發(fā)S.typhimurium弱毒苗或作為外源抗原在機(jī)體內(nèi)的投遞系統(tǒng)提供了保障。

綜上所述，本研究在以S.typhimuriumSL1344△cya為親本株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了其crp基因缺失株，該雙缺失株生長(zhǎng)速度更加緩慢，毒力進(jìn)一步降低，而且其遺傳穩(wěn)定。該菌是通過重組自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)細(xì)菌基因的等位交換技術(shù)構(gòu)建，不含有任何抗生素抗性基因，基因背景清晰，為研制安全有效的S.typhimurium疫苗及其疫苗載體奠定了基礎(chǔ)。

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