胡祥 劉沐蕓 楊曉菲

由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率較高，感染者進(jìn)而罹患急慢性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化、肝癌的事件屢見(jiàn)不鮮，肝臟疾病目前已經(jīng)成為中國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生的主要負(fù)擔(dān)之一[1]。肝臟疾病進(jìn)展到肝硬化等終末期肝病時(shí)，通常累及廣泛肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，肝組織再生能力下降，造成肝功能失代償并最終導(dǎo)致肝功能衰竭[2]。常規(guī)的內(nèi)科保肝治療效果不佳，病死率很高。目前原位肝移植仍然是治療終末期肝病最有效的措施，但供體缺乏、移植排斥反應(yīng)及免疫抑制劑所引起的并發(fā)癥等都嚴(yán)重限制了其應(yīng)用[3]。近年來(lái)干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為治療終末期肝病帶來(lái)了新的希望。干細(xì)胞療法因其簡(jiǎn)單易行，創(chuàng)傷小而成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

很多的研究證明骨髓可以用作肝干細(xì)胞移植的來(lái)源。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓內(nèi)的一組干細(xì)胞，目前被認(rèn)為具有廣泛的治療前景[4]。MSCs具有高度自我更新能力和多向分化潛能，其在特定條件下能夠橫向分化為肝細(xì)胞的研究為其移植治療肝臟疾病提供了理論依據(jù)。本文將對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）在治療肝病方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、MSCs作為肝臟干細(xì)胞的直接證據(jù)

在適當(dāng)?shù)臈l件下，源于中胚層的BM-MSCs可以跨越胚層向內(nèi)胚層及外胚層的組織、細(xì)胞分化，比如分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞等[5-6]。這一特性使得MSCs在臨床治療方面的應(yīng)用獲得了關(guān)注。

MSCs之所以具有好的治療前景，是因?yàn)樗鼈兛梢员环N植并在特定的器官中可以長(zhǎng)期存活。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，MSCs移植術(shù)后，供體的細(xì)胞可以插入到受體動(dòng)物體內(nèi)不同的間質(zhì)組織中[7-8]。另有研究顯示，在小鼠肝損傷模型中輸注MSCs，可以提高小鼠的短期生存率，可能是由于MSCs改變了小鼠免疫細(xì)胞的功能，可以降低細(xì)胞壞死率并促進(jìn)肝臟細(xì)胞的再生[9]。

MSCs在活體內(nèi)、外均能夠分化為具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。Lee等[10]將人骨髓和臍帶血來(lái)源的MSCs用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)和Oncostatin M進(jìn)行誘導(dǎo)，4周后，細(xì)胞呈現(xiàn)肝細(xì)胞典型形狀。同時(shí)，這些細(xì)胞以時(shí)間依賴的方式表達(dá)肝細(xì)胞特異的標(biāo)志基因，并能夠分泌白蛋白和尿素，儲(chǔ)備糖原，攝取低密度脂蛋白等。Sato等[11]用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)染的大鼠BM-MSCs與新鮮分離的大鼠肝細(xì)胞體外共同培養(yǎng)，2周后即在綠色熒光蛋白陽(yáng)性的BMMSCs檢測(cè)到白蛋白及CK18。諸多體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境(如生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì))在調(diào)節(jié)MSCs向肝細(xì)胞系特異性分化中起了至關(guān)重要的作用，甚至超過(guò)了HGF等生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)作用。Qihao等[12]將MSCs與成體肝細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)MSCs像肝樣細(xì)胞進(jìn)行分化。研究結(jié)果顯示，共培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)肝細(xì)胞典型形態(tài)，并表現(xiàn)出正常的增生能力，在mRNA和蛋白水平大量表達(dá)白蛋白、甲胎蛋白和CK18。Arikura等[13]將先天性白蛋白缺乏癥大鼠肝臟做70﹪切除后，立即通過(guò)門靜脈植入正常大鼠BM-MSCs，4周后在受體肝臟檢測(cè)到白蛋白陽(yáng)性并表達(dá)白蛋白mRNA的肝細(xì)胞，血清中也檢測(cè)到白蛋白。

Han等[14]研究顯示，來(lái)源于HBV相關(guān)失代償肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Monouclear Cell，PBMC）也可以分化為肝細(xì)胞樣的細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞的標(biāo)志物，并在體外培養(yǎng)中顯示出特定的肝臟生物學(xué)功能。而接受了自體PBMC細(xì)胞移植的患者，癥狀改善持續(xù)達(dá)一年多，患者體內(nèi)的肝細(xì)胞樣細(xì)胞被檢測(cè)出表達(dá)肝臟特異的基因，并可以合成分泌白蛋白，尿素，轉(zhuǎn)氨酶和糖原，與正常的人肝細(xì)胞株QZG十分相似。

二、MSCs治療作用的可能機(jī)制

臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明，MSCs能夠促進(jìn)肝損傷后的內(nèi)源性肝細(xì)胞重建，并可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能的機(jī)制包括細(xì)胞替代和旁分泌作用[15]。另一項(xiàng)新的研究顯示，骨髓來(lái)源的MSCs可以在特定條件下分化成肝樣細(xì)胞，并且誘導(dǎo)效率可達(dá)100﹪[16]。將這種來(lái)源的肝樣細(xì)胞移植到免疫缺陷的肝衰竭小鼠模型中，可以使小鼠存活，并重塑高達(dá)5﹪的受體肝組織。盡管MSCs來(lái)源的肝樣細(xì)胞能夠在移植術(shù)后的受者體內(nèi)被檢測(cè)出，但對(duì)于暴發(fā)型肝衰竭（fulminant hepatic failureF，F(xiàn)HF）的快速治療作用提示MSCs療法除了直接分化成干細(xì)胞的細(xì)胞替代機(jī)制，尚存在其他機(jī)制。MSCs對(duì)氧化應(yīng)激作用的抑制作用，能夠使受體小鼠迅速恢復(fù)，刺激肝細(xì)胞的增生，均提示MSCs可能通過(guò)旁分泌作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[15]。

諸多研究者認(rèn)為干細(xì)胞旁分泌作用所分泌的細(xì)胞因子對(duì)肝臟損傷的修復(fù)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究顯示MSCs能夠分泌多種生物活性因子，如HGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/CXC趨化受體4(SDF-1/CXCR4)等。HGF能夠?qū)Ω螕p傷進(jìn)行正向調(diào)節(jié)，促進(jìn)移植的骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）向肝細(xì)胞分化，且通過(guò)與SDF-1的相互作用對(duì)干細(xì)胞的替代與補(bǔ)充起重要作用[17]。另外，HGF的分泌可以抑制損傷肝臟中殘存的肝細(xì)胞的進(jìn)一步凋亡[18]。Jung等[19]將同種異體的BMSCs移植到CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，觀察發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后模型鼠的肝脾腫大及肝壞死均得到不同程度改善，移植的干細(xì)胞能夠特異地遷移到受損的肝組織。MSCs可以通過(guò)旁分泌作用調(diào)節(jié)肝纖維化過(guò)程中剩余肝臟星形細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的作用，抑制肝硬化的發(fā)展。Parekkadan等[18]研究了MSCs移植術(shù)后對(duì)肝纖維化的SCs的免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs誘導(dǎo)白介素10(?IL-10?)的分泌，所營(yíng)造的細(xì)胞微環(huán)境促進(jìn)HSCs細(xì)胞IL-6的分泌，促進(jìn)HSCs的增殖及相關(guān)抗原的合成。這表明MSCs細(xì)胞對(duì)肝纖維化和肝臟的炎癥反應(yīng)具有治療作用，對(duì)于終末期肝病的治療用樣具有意義。

另外，MSCs因其移植術(shù)后可以在特定器官存活較長(zhǎng)時(shí)間。Allers等[8]將人MSCs移植入成體小鼠內(nèi)，示蹤技術(shù)在小鼠骨髓、脾臟及其他間充質(zhì)組織觀察到MSCs細(xì)胞的存在，隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，4～13個(gè)月后，在骨、軟骨和肌肉組織中觀察到大量的人源細(xì)胞，表明MSCs向特定組織細(xì)胞的分化與遷移。

三、BM-MSCs移植治療肝臟疾病

（一）臨床前實(shí)驗(yàn)

BM-MSCs在活體內(nèi)、外轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，為臨床治療遺傳及獲得性終末期肝病提供了潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了移植到肝臟的MSCs參與受損肝臟的功能修復(fù)。Sakaida等[20]將自體骨髓細(xì)胞移植到GFP/CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝硬化模型，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞在損傷的肝組織內(nèi)能有效地增殖分化為肝細(xì)胞，其能夠分泌白蛋白，并改善肝臟功能，從而提高了患病小鼠的生存率。

細(xì)胞因子對(duì)肝損傷的修復(fù)有重要作用，已有很多研究顯示細(xì)胞因子聯(lián)合MSCs移植可促進(jìn)移植細(xì)胞向干細(xì)胞進(jìn)行分化。Ishikawa等[21]發(fā)現(xiàn)FGF能夠促進(jìn)移植的BMSCs分化為肝細(xì)胞，將FGF-2聯(lián)合BMSCs移植到CCl4誘導(dǎo)的鼠肝損傷模型后，發(fā)現(xiàn)模型鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平升高，生存率也得以提高。Oyagi等[22]將鼠BMSCs在加有HGF的條件下培養(yǎng)2周，熒光標(biāo)記后均移植到CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷模型內(nèi)，發(fā)現(xiàn)加HGF培養(yǎng)的BMSCs恢復(fù)了模型鼠的血清白蛋白水平，并顯著降低了轉(zhuǎn)氨酶，抑制了肝纖維化。

如前所述，MSCs可以通過(guò)旁分泌作用激活損傷的肝臟中剩余HSCs的作用，抑制肝硬化的發(fā)展[18]。Zhao等的研究[23]報(bào)道，將MSCs移植入小鼠的肝纖維化模型中，可以觀察到MSCs移植可以降低CCl4或DMN誘發(fā)對(duì)小鼠纖維化的發(fā)生率。另外，MSCs移植組小鼠肝臟的膠原沉著量和α-SMA染色較對(duì)照組低40﹪～50﹪，纖維化指標(biāo)也有類似的結(jié)果。應(yīng)用中藥歸元方聯(lián)合自體BMSCs移植治療大鼠肝纖維化模型，該聯(lián)合療法可以減小肝損傷區(qū)域，使肝功能及肝纖維化評(píng)分獲得一定程度的改善。免疫組化結(jié)果顯示移植的BMSCs能在肝損傷及肝纖維化所形成環(huán)境中可以存活并進(jìn)行增殖，進(jìn)而向肝細(xì)胞進(jìn)行分化[24]。動(dòng)物模型的報(bào)道進(jìn)一步明確了BMSCs具有與胚胎干細(xì)胞相似的干細(xì)胞特性，即這些細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)及擴(kuò)增而保持其干細(xì)胞的多向分化潛能，為其成為干細(xì)胞移植療法的種子細(xì)胞提供了臨床前依據(jù)。

（二）臨床研究

臨床上研究MSCs對(duì)肝臟的修復(fù)作用至少應(yīng)該包括兩個(gè)方面，即對(duì)受損肝臟功能的恢復(fù)以及促進(jìn)受損肝臟的再生。Mohamadnejad等[25]應(yīng)用MSCs移植治療失代償肝纖維化的一期臨床試驗(yàn)顯示，MSCs移植術(shù)后，4例患者的癥狀均有不同程度改善，肝臟的體積也有所增加。自體MSCs取自患者髂后上棘，細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，經(jīng)外周靜脈輸注進(jìn)患者體內(nèi)。輸注的細(xì)胞總體積為20 ml，平均細(xì)胞數(shù)目約為3.2 × 107。干細(xì)胞輸注后，未發(fā)生與治療相關(guān)的不良反應(yīng)，CT檢查亦未見(jiàn)局灶性的肝臟損傷。隨訪6個(gè)月和12個(gè)月的數(shù)據(jù)顯示，相比治療前，所有患者的外周水腫有顯著改善。6個(gè)月時(shí)，肝功能相關(guān)的生化檢查以及MELD評(píng)分的改善情況最明顯，大多數(shù)患者的改善可以持續(xù)12個(gè)月。影像學(xué)檢查顯示，6個(gè)月時(shí)，3例患者的肝臟體積有所增加。SF-36問(wèn)卷調(diào)查提示患者在干細(xì)胞治療后生活質(zhì)量（生理和心理方面）明顯改善。該研究不僅顯示MSCs可以改善終末期肝硬化患者的肝臟功能，同時(shí)，肝臟體積的增加提示，MSCs可能在抑制肝纖維化，促進(jìn)肝臟再生方面有一定的作用。

Terai等[26]報(bào)道將9例肝硬化患者的自體BMSCs通過(guò)外周靜脈輸注到患者體內(nèi)，移植24周后觀察發(fā)現(xiàn)所有患者血清白蛋白、總蛋白及Child-Pugh評(píng)分均有顯著提高。Kharazih等[27]報(bào)道了另一項(xiàng)Ⅰ-Ⅱ期臨床試驗(yàn)，將自體MSCs經(jīng)外周血或門靜脈輸注到8例肝硬化患者體內(nèi)，輸注的平均細(xì)胞數(shù)為(3～5)× 107。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有患者均能很好的耐受干細(xì)胞輸注，隨訪3個(gè)月，未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，并可不同程度改善肝臟功能。肝臟功能指標(biāo)，如MELD評(píng)分從治療前的17.9 ± 5.6減低到治療后的 10.7 ± 6.3（P< 0.05）；治療后，凝血酶原復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)比從 1.9 ± 0.4 減至 1.4 ± 0.5(P< 0.05)；血清肌氨酸酐在治療前為（114 ± 35）μmol/L，治療后則降至（80 ± 18）μmol/L(P< 0.05）；血清白蛋白水平有所升高，而血清膽紅素則有所下降。

上述研究均表明MSCs移植治療肝纖維化是安全可行的，適宜的移植細(xì)胞種類和數(shù)目，可不同程度促進(jìn)失代償肝硬化患者的癥狀改善。Lorenzini等[28]通過(guò)對(duì)干細(xì)胞移植研究的綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為目前干細(xì)胞移植用于治療肝病患者的臨床研究結(jié)果令人鼓舞，但為了更好地救治患者，進(jìn)一步的研究需要合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行良好的隨機(jī)對(duì)照，以保證干細(xì)胞療法的安全有效。盡管上述研究規(guī)模不大，欠缺對(duì)輸注入體內(nèi)的干細(xì)胞的追蹤，但所取得臨床效果是非常顯著的，進(jìn)一步的研究需增大樣本量，進(jìn)行體內(nèi)干細(xì)胞示蹤，提高實(shí)驗(yàn)的整體嚴(yán)謹(jǐn)性，增加臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證效能，使得細(xì)胞療法更加安全、有效和可控，并可以早日用于臨床治療。

四、小結(jié)與展望

干細(xì)胞不僅可以成為肝衰竭患者度過(guò)危險(xiǎn)期、等待肝源進(jìn)行肝移植的一個(gè)過(guò)渡方法，又能直接修復(fù)損傷肝臟，改善肝臟功能，作為細(xì)胞療法應(yīng)用于臨床治療肝衰竭、各種終末期肝病具有非常好的前景。

但將MSCs廣泛應(yīng)用于臨床，尚需要我們關(guān)注以下一些方面的問(wèn)題。首先，移植的MSCs在肝臟疾病發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中具體的生物學(xué)行為，如移植術(shù)后的定位跟蹤及體內(nèi)分化，細(xì)胞是否在體內(nèi)長(zhǎng)久存留的可能致瘤性，以及是否容易受HBV感染而發(fā)生整合等。其次，探討更具有優(yōu)越性的干細(xì)胞來(lái)源。BMSCs目前仍是干細(xì)胞移植應(yīng)用最多的細(xì)胞，但脂肪來(lái)源和臍帶來(lái)源的MSCs被證實(shí)也可作為肝臟疾病干細(xì)胞療法的種子細(xì)胞，并具有相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。如臍帶干細(xì)胞來(lái)源廣泛，體外擴(kuò)增簡(jiǎn)單高效，不失為MSCs的一種良好來(lái)源。第三，干細(xì)胞療法的具體治療策略的確定。干細(xì)胞輸注途徑、細(xì)胞數(shù)量和治療時(shí)間的選擇等都對(duì)干細(xì)胞療法的有效性有至關(guān)重要的意義，如最佳治療時(shí)機(jī)的選擇，在肝纖維化早期運(yùn)用干細(xì)胞療法進(jìn)行干預(yù)，可能會(huì)逆轉(zhuǎn)或改善纖維化進(jìn)程，阻止疾病的惡性進(jìn)展，從而達(dá)到較好的治療效果。第四，開(kāi)展基因修飾干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究，可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的問(wèn)世，使得干細(xì)胞療法的前景更加美好。最后但非常重要的是，應(yīng)強(qiáng)調(diào)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的法規(guī)和行業(yè)準(zhǔn)入制度，以保證臨床研究和臨床治療能夠遵循相應(yīng)的臨床實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，從而保證患者的利益。

目前的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示出，MSCs在終末期肝病治療方面的良好效果，因此，隨著大規(guī)模和更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究的進(jìn)一步驗(yàn)證，MSCs療法無(wú)疑會(huì)成為終末期肝病治療方法的另一選擇。

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