中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會干細胞工程專業(yè)委員會

中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會血管外科學(xué)組

一、概述

下肢缺血是一種常見癥狀。在我國造成下肢缺血的主要病因是動脈粥樣硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足等。下肢動脈硬化閉塞癥的發(fā)病率10﹪。隨著年齡的增長，其發(fā)病率呈上升趨勢，70歲以上人群的發(fā)病率在15﹪～20﹪。下肢動脈硬化閉塞癥的預(yù)后較差，其中間歇性跛行患者5年病死率30﹪，而靜息痛、潰瘍和壞疽的下肢缺血患者5年病死率達70﹪，主要死亡原因是冠心病和腦血管疾病。下肢缺血的主要臨床表現(xiàn)為下肢涼、麻木、無力、間歇性跛行、靜息痛和肢體缺血性潰瘍、壞疽等。國內(nèi)外臨床常用的分期方法有Fontaine法和Rutherford法。下肢缺血的治療目的是增加行走的距離，緩解疼痛，促進潰瘍愈合和避免截肢。血管重建是治療重癥下肢缺血的最佳方案，但要根據(jù)患者的臨床癥狀和全身情況選擇。主要治療方法包括藥物治療、血管腔內(nèi)治療、手術(shù)治療以及干細胞移植和基因治療等。由于對全身情況和血管條件的限制，動脈旁路手術(shù)和血管腔內(nèi)成形術(shù)(球囊擴張、支架植入)適用于多數(shù)有條件的患者。對于不適合上述治療及上述治療效果不佳或術(shù)后復(fù)發(fā)者，尤其是糖尿病下肢缺血和血栓閉塞性脈管炎患者，病變多累及下肢遠端小動脈，缺乏安全和有效的治療方法，這部分患者面臨截肢的危險，甚至危及生命。自體干細胞移植作為近年來血管再生的新技術(shù)，為這部分患者提供了一種新的治療選擇。

自體干細胞移植治療下肢缺血的主要目標(biāo)是促進下肢血管新生。其中起主要作用的是能形成血管的成體干細胞（包括血管內(nèi)皮祖細胞、間充質(zhì)干細胞和造血干細胞等）。正常情況這些干細胞主要存在于骨髓中，外周血液循環(huán)中很少。當(dāng)存在肢體缺血時，這些干細胞將動員到外周血中，歸巢到缺血組織，發(fā)揮血管新生的作用。通過藥物進行骨髓動員刺激后這些干細胞也可以被動員到外周血液循環(huán)中。

目前研究認為，骨髓單個核細胞中的CD34陽性細胞是內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）的主要來源，CD34(造血干細胞及EPC的共有表面標(biāo)記物)細胞在末梢血中只有骨髓的0.2﹪?？蓽y定的最幼稚細胞在1 ml末梢血中僅有2.9個，為骨髓的1﹪。提示骨髓細胞有可能提供更多的EPC用于血管新生療法。成年個體的骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cell，BM-MNC)中含有多種干細胞成分，其中CD34陽性細胞含量約占BM-MNC總數(shù)的3﹪，為外周血的15倍，同時BM-MNC移植還可以提供多種促血管生長因子，故BM-MNC移植兼具EPC和細胞生長因子的作用。在高齡、糖尿病和動脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下，患者EPC的數(shù)量、增殖潛能、黏附和成血管能力均降低，說明這些患者自發(fā)的血管新生潛能降低，進一步支持了對這些患者進行干細胞移植的必要性。

根據(jù)干細胞的不同來源，目前臨床上自體干細胞移植治療慢性下肢缺血的方式分3種：即自體骨髓干細胞移植、自體外周血干細胞移植和改良的自體骨髓干細胞移植（即骨髓動員后的自體骨髓干細胞移植）。

自體干細胞移植至少有以下幾個優(yōu)點：（1）不存在異體干細胞的免疫排斥；（2）沒有胚胎干細胞的倫理道德問題；（3）作為自體的細胞，僅僅是采用富集提純的辦法，沒有在體外進行誘導(dǎo)分化和增殖，也不存在異種血清污染和基因突變等風(fēng)險；（4）在嚴格無菌下操作，體外分離時間短（2 h），微生物污染的可能性?。唬?）正如患者本身的植皮一樣，都是患者本身的組織，具有取材方便的特點；（6）自體干細胞移植治療血液疾病已有幾十年的歷史。因此，目前自體干細胞移植治療肢體缺血性疾病呈現(xiàn)出廣闊的前景。

二、自體干細胞移植的方法

（一）自體骨髓干細胞移植

先局麻下抽取患者的骨髓血，然后將抽取的骨髓血在干細胞實驗室分離純化得到BM-MNC，再通過肌注或動脈內(nèi)注射的方式進行缺血肢體的移植。在單純骨髓干細胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400～500 ml，得到的BM-MNC總數(shù)在（1～3）×109個。由于患者大多年齡比較大，體弱并多伴有糖尿病、高血壓、冠狀動脈硬化性心臟病或/和腦動脈硬化癥等，如果1次抽取過多的骨髓血，會增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生?？赏ㄟ^同時輸血或減少采髓量的辦法來克服這一缺點。

（二）自體外周血干細胞移植

先采用骨髓動員的方法[皮下注射粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF) 5～7 d]將骨髓中的干細胞動員到外周血液循環(huán)中，通過專用的單個核細胞分離機，將含有造血干細胞的單個核細胞分離出來，然后再移植到患者本人的缺血局部（通過缺血局部肌肉注射或者通過動脈腔內(nèi)注射），從而達到促進血管新生，緩解肢體缺血的目的?；颊卟粫а?，而一次得到的單個核細胞總數(shù)一般可達1010量級。缺點是長時間的骨髓動員會使大量有核細胞進入血循環(huán)，導(dǎo)致血液黏稠度增加，血管內(nèi)血栓形成的機會增加，增加心肌梗死和腦梗塞發(fā)生的危險。因此，在骨髓動員早期就應(yīng)采用正規(guī)的抗凝措施，在整個過程中需要注意心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。

（三）改良的骨髓干細胞移植

為避免在單純骨髓干細胞移植中抽取骨髓血量過多的問題，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院谷涌泉等發(fā)明了改良的骨髓干細胞移植方法。即骨髓動員刺激以后的骨髓干細胞移植。主要步驟是在抽取骨髓前先使用G-CSF短期動員骨髓（2～3 d），在大量增殖的干細胞仍在骨髓中未進入外周血之前，抽取骨髓血200 ml，在干細胞實驗室分離純化BM-MNC后再進行移植。從臨床研究的資料中發(fā)現(xiàn)：無論是主觀評價指標(biāo)，還是客觀評價指標(biāo)均比單純的骨髓干細胞移植和外周血干細胞移植的療效更好，而且不良反應(yīng)也較外周血干細胞少。與前2種方式相比較，此方式的主要優(yōu)點是：（1）抽取骨髓血量少（200 ml），對患者全身影響不大；（2）動員時間短，外周血液中單個核細胞的數(shù)量不高，血液黏稠度比外周血干細胞低，發(fā)生心腦血管意外的幾率較?。唬?）可以獲得大量的骨髓干細胞。

三、臨床應(yīng)用

（一）實施條件

1.技術(shù)準(zhǔn)入：盡管是自體干細胞移植，沒有異體干細胞的免疫排斥，也不存在胚胎干細胞的倫理道德問題，但是專家們一致認為，要有醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會和新技術(shù)委員會或相關(guān)部門的批準(zhǔn)。

2.人員資質(zhì)準(zhǔn)入：（1）專業(yè)人員需經(jīng)過相關(guān)的業(yè)務(wù)培訓(xùn)；（2）需要相關(guān)專業(yè)副主任醫(yī)師以上人員負責(zé)實施。

3.實驗室設(shè)施和條件：（1）萬級實驗室；（2）離心機；（3）擬行外周血干細胞移植的單位要有血細胞分離機。

（二）患者的選擇

1.適應(yīng)證：（1）各種原因?qū)е碌穆韵轮毖约膊o法行手術(shù)搭橋或者介入治療，而保守治療無效者；（2）無法耐受旁路手術(shù)和介入治療的患者。

2.禁忌證：（1）過去5年內(nèi)明確有惡性疾病的患者或血中腫瘤標(biāo)記物（AFP，CEA，PSA，CA19-9，CA125）水平明顯升高者；（2）嚴重心、肺、肝、腎功能衰竭或一般狀況很差不能耐受干細胞移植手術(shù)者；（3）近期有心肌梗死或腦梗塞病史者禁忌；（4）主動脈、髂動脈等大動脈閉塞者。

（三）自體干細胞移植的圍手術(shù)期處理

1.患者的思想準(zhǔn)備：詳細地向患者說明干細胞移植方法及其優(yōu)點和不足之處，使患者有比較充分的準(zhǔn)備。特別要說明干細胞的微創(chuàng)性，使患者消除顧慮，輕裝上陣。

2.患者的身體準(zhǔn)備：在取髓和移植部位要備皮。需要血管腔內(nèi)介入的患者，術(shù)前先行碘過敏試驗，對糖尿病與腎功能不全、脫水患者術(shù)前開始水化，糖尿病患者術(shù)前停用二甲雙胍。有感染的患者合理選用抗生素抗感染治療。

手術(shù)當(dāng)天要禁食水，靜脈輸液保證患者基本的需求量和營養(yǎng)。如果術(shù)前血色素低于10 g/L，建議備血200 ml，在抽取骨髓血時緩慢輸血。

3.干細胞移植術(shù)前骨髓動員：皮下注射G-CSF 5～10 μg / kg，1 次 /d，外周血干細胞移植動員4～5d，改良骨髓干細胞移植動員2～3d，每日監(jiān)測WBC不超過5萬/μl，外周血干細胞移植最好待外周血CD34+細胞數(shù)達10～20個/μl再采集外周血干細胞。動員開始即應(yīng)給予抗凝和抗血小板治療，阿司匹林0.1 g，1次/d；低分子肝素0.4～0.6 ml，皮下注射，1次/12 h或普通肝素4000 u，皮下注射，1次/8 h?？鼓涂寡“逯委熤辽俪掷m(xù)至外周血白細胞恢復(fù)正常。

（四）實驗室的處理（干細胞制備）

骨髓血的收取、轉(zhuǎn)送應(yīng)由專人負責(zé)，以免混淆。制備過程必須嚴格無菌操作，流程規(guī)范化，使用密度梯度離心法進行分離制備，也可以選用不同型號的全自動細胞分離系統(tǒng)，干細胞以生理鹽水稀釋至所需容量，制備的干細胞只能在4℃冰箱短時間保存，計數(shù)細胞總數(shù)，活力測定，有條件時推薦用流式細胞儀鑒定骨髓干細胞的成分。

（五）干細胞移植的方法、步驟和措施

一般移植方法有2種，分別為缺血肢體的局部肌肉注射移植和下肢動脈腔內(nèi)注射移植。醫(yī)生可根據(jù)患者的全身情況和病變情況選擇適合的方法進行移植。

1.局部缺血肌肉注射法：（1）麻醉多選用靜脈復(fù)合麻醉，也可選用硬膜外或者腰麻，由于注射范圍廣，次數(shù)多，局部麻醉不推薦；（2）抽取20～50 ml的生理鹽水稀釋制備好的干細胞懸濁液，然后抽取上述稀釋后的干細胞懸液備用；（3）在缺血肢體劃出要注射的具體位置，一般針距2 cm，每針注射0.75～1 ml；（4）注射后用酒精紗布消毒皮膚后包扎注射部位。

2.下肢動脈腔內(nèi)注射：（1）一般選用局部麻醉，穿刺動脈，放置動脈鞘管，肝素抗凝；（2）用導(dǎo)絲和導(dǎo)管選擇到下肢病變動脈，送入并充盈球囊，阻斷動脈后將干細胞懸液緩慢推入動脈腔內(nèi)，3～5 min完成，放松球囊并撤除；（3）退出動脈鞘，壓迫并包扎穿刺點。

（六）干細胞移植術(shù)后的處理

1.術(shù)后根據(jù)需要應(yīng)用抗生素。

2.對于局部注射患者，術(shù)后2～3 d撤除包扎的紗布。

3.對于動脈腔內(nèi)注射患者，一般術(shù)后需下肢制動6 h，臥床24 h。術(shù)后建議用低分子肝素預(yù)防血栓形成。

（七）干細胞移植術(shù)后評價

1.安全性評價：干細胞移植的安全性問題不容回避。對干細胞移植安全性的憂慮主要是免疫排斥和腫瘤生長的問題。對于安全性的評價，必須注意下面幾點：是否有致瘤性，有無局部的不良反應(yīng)，包括局部有無紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)及過敏反應(yīng)，有無全身的不良反應(yīng)，術(shù)后肝腎等功能的變化。一旦出現(xiàn)嚴重不良事件應(yīng)按規(guī)定報告醫(yī)院相關(guān)主管部門。

2.有效性評價：臨床觀察有效性的主要指標(biāo)和方法主要包括主觀指標(biāo)和客觀指標(biāo)。其中主觀指標(biāo)包括以下幾點：疼痛、冷感和麻木等癥狀的改善程度。

（1）疼痛評分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無疼痛；1分：偶有疼痛，被問及能回憶起；2分：疼痛經(jīng)常出現(xiàn)但能耐受，不需或偶用一般止痛劑；3分：經(jīng)常用一般止痛劑；4分：因疼痛影響睡眠，一般止痛藥劑難以緩解。

（2）冷感評分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無冷感；1分：患者偶述受累肢體有發(fā)涼、怕冷的感覺；2分：受累肢體經(jīng)常有發(fā)涼、怕冷的感覺；3分：受累肢體有明顯的冷、涼感覺，需要采用局部保溫措施，癥狀能得到一定程度的緩解；4分：受累肢體有明顯的冷、涼感覺，采用局部保溫措施，癥狀也無明顯改善。

（3）麻木評分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無麻木；1分：偶感輕度麻木；2分：經(jīng)常有輕度麻木不適；3分：麻木感覺明顯，但可以忍受；4分：麻木非常明顯，難以忍受，嚴重影響日常生活。

3.客觀評價標(biāo)準(zhǔn)主要包括：（1）間歇跛行的距離（干細胞移植前后跛行距離的變化）：主要測定無痛步行時間（分）或跛行距離（米），此項指標(biāo)帶有一定的主觀性，但是如果使用平板實驗，則是一種非常簡單和客觀的指標(biāo)；（2）皮膚的溫度差（雙下肢）：移植前后的變化；（3）經(jīng)皮氧分壓（TCPO2）：作為全球通用的3大評估血管疾病金標(biāo)準(zhǔn)之一，直接反映血管向組織供氧情況，可以對肢體缺血情況的定量評估，可以評估組織存活率，是一種無創(chuàng)，低成本并可重復(fù)使用的檢查方法，經(jīng)皮氧分壓測定，是一種比較客觀的指標(biāo)，國外經(jīng)常用此項檢查作為截肢與否和預(yù)測截肢平面，一般臨床上以20 mm Hg（1 mm Hg = 0.133 kPa）作為臨界值，不過受周圍環(huán)境影響較大，因此檢查前患者一定靜息平臥30 min以上，檢查室內(nèi)溫度要保持恒溫；（4）患肢紫紺及潰瘍的面積和深度（mm），壞疽范圍測量并標(biāo)記，作為客觀的評價指標(biāo)之一，能夠證明干細胞移植后是否有效。不過，即使血供得到了改善，潰瘍面的愈合仍需要一定的時間，尤其是較大潰瘍者，一般近期療效中僅適用于小潰瘍者；（5）靜息狀態(tài)下踝肱指數(shù)（ankle brachial index，ABI）及趾肱指數(shù)（toebrachial index，TBI）：是一種簡單、方便和有效的客觀評價指標(biāo)，但是不少患者在短期內(nèi)不會明顯增加；（6）激光多普勒血流量的測定：作為一種評價下肢血供的金標(biāo)準(zhǔn)之一，具有靈敏度高，操作簡單的優(yōu)點，是一種非常好的無創(chuàng)檢查的評價指標(biāo)；（7）數(shù)字減影血管造影術(shù)（digital subtraction angiography，DSA）：觀察側(cè)支血管形成情況并評分。根據(jù)新生側(cè)支血管評估分4級：0級（無新生側(cè)支血管）、+1級（少許新生側(cè)支血管）、+2級（中量新生側(cè)支血管）和+3級（豐富新生側(cè)支血管）；（8）截肢率及截肢平面的變化：由于血管性截肢與血液供應(yīng)具有相關(guān)性，截肢平面經(jīng)常受到血液供應(yīng)的影響，如果移植前后的截肢平面有一定的變化，能夠達到降低截肢平面的目的，也能夠說明干細胞移植的有效性。

（八）術(shù)后隨訪

推薦術(shù)后第1、3、6和12個月時各隨訪1次，第2年每半年隨訪1次。此后每年隨訪1次。

執(zhí)筆人：谷涌泉（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科）

本專家共識由中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會干細胞工程專業(yè)委員會和中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會血管外科學(xué)組頒布，歷時2年多時間，經(jīng)過國內(nèi)（血管外科、內(nèi)分泌、干細胞研究等專業(yè)）汪忠鎬（院士）、吳祖澤（院士）、付小兵（院士）、曹誼林、韓忠朝、張傳森、辛世杰、李曉強、金畢、舒暢、胡何節(jié)、楊鏞、畢偉、高涌、周興立、郭連瑞、崔鳳琴、沈飛霞、趙湜、王富軍、王懷林、胡玲、黃文、呂曉霞、苗俊英、周慧敏、賈黎靜等50多名專家反復(fù)討論共同修改完成。