朱賢鑫 孫星慧 譚建明

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占2﹪～ 3﹪左右，在泌尿系所有腫瘤中是最致命的。流行病學資料顯示，超過40﹪的RCC患者死于該病，而前列腺癌和膀胱癌的病死率僅為20﹪。RCC的基本治療是根治性腎切除術(shù)，對放射治療和化療都不敏感[1-2]。且RCC易復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后差，并具有多藥耐藥性[3]。目前認為RCC組織中也存在腫瘤干細胞。2001年Reya等[4]提出了腫瘤干細胞學說，1年后A1-Awqati等[5]就提出了RCC干細胞的假設，近年國內(nèi)外對RCC干細胞進行大量的研究，并關(guān)注RCC干細胞的靶向治療，希望找到并明確RCC干細胞的表面標志物及其微環(huán)境，通過其表面標志物和微環(huán)境來研發(fā)一種治療RCC及控制其復發(fā)和轉(zhuǎn)移的藥物，來延長RCC患者的生存時間。

一、干細胞的定義

干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化增殖潛能的原始細胞，根據(jù)干細胞的來源及分化潛能的不同分為：(1)全能干細胞，如胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)，具有向機體各類細胞分化的潛能；(2)多能干細胞，如成體干細胞(adult stem cells, ASCs)，能分化成除了胚胎以外的任何一種細胞；(3)單能干細胞，如造血干細胞，能分化為特定功能的細胞和特定組織的細胞。干細胞都具有永生性(longevity)、多向分化潛能(pluripotency)及自我更新 (self-renewal)3 大特性[4、6]。

二、腫瘤干細胞(Cancer stem cells, CSCs)

腫瘤是一種單克隆細胞起源，經(jīng)無限增殖形成的惡性疾病。2001年Reya等[4]發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤浸潤性生長、局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的特點與干細胞基本特征十分相似，繼而推測腫瘤是干細胞增殖分化失調(diào)而產(chǎn)生的異常組織，在干細胞的理論基礎上提出了CSCs學說。2006年美國癌癥研究協(xié)會(American Association for Cancer Research, AACR)CSCs研究小組一致將CSCs定義為：存在于腫瘤組織中的具有無限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細胞的細胞[7]。

CSCs的幾個特點：（1）具有無限的自我更新能力，能產(chǎn)生與上一代細胞完全相同的子代細胞；（2）具有分化潛能，即可以產(chǎn)生不同分化程度的子代腫瘤細胞，用于解釋腫瘤細胞的異質(zhì)性；（3）高致瘤性，實驗證明CSCs比非CSCs具有更高的成瘤潛能，很少量的CSCs在體外動物培養(yǎng)中即可形成腫瘤；（4）特異性的表面標志，CSCs具有其特異性的表面標志，如急性髓系白血病(acme myeloid leukemia, AML) 的表面標志為 CD34+CD38-，神經(jīng)CSCs的表面標志為CD133+；（5）具有耐藥性，CSCs膜上表達的ABC家族膜轉(zhuǎn)運蛋白可運輸并排出代謝產(chǎn)物、藥物及毒性物質(zhì)等多種物質(zhì)，使化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用減弱，是腫瘤治療失敗的重要原因[8]。CSCs的研究最早源于AML的CSCs。Bonnet等[9]成功分離出人類AML干細胞。并確定其表面標志為CD34+CD38-，這一研究首次證實了CSCs的存在。隨后，人們發(fā)現(xiàn)CSCs不僅僅存在于AML，同樣也存在實體瘤中。2003年Al-najj等[10]首先利用NOD/SCID小鼠模型，從乳腺癌細胞中分離鑒定出具有干細胞類似生物學特性的細胞群體。這是首次在實體瘤中發(fā)現(xiàn)CSCs的存在。之后在腦腫瘤[11]、胰腺癌[12]、前列腺腫瘤[13]等實體瘤中也證實了CSCs的存在。對以上這些癌癥的研究表明，惡性腫瘤的增殖、復發(fā)、轉(zhuǎn)移及對放化療不敏感性與CSCs有密切的關(guān)系。

CSCs與干細胞之間存在著很多相似的特點[14]：(1)兩者均具有自我更新和無限增殖能力，增殖的同時可誘導血管生成；(2)均有較高的端粒酶活性以及擴增的端粒重復序列；(3)均通過兩種分裂的形式來保持其細胞特性；(4)干細胞的遷移和CSCs的轉(zhuǎn)移都有一定的組織和器官特異性，且二者皆受特異性化學因子及其受體的調(diào)節(jié)；(5)二者有許多相似的生長調(diào)控機制，如Wnt，Sh2，Notch途徑；(6)自我更新越頻繁的組織，干細胞自我更新率越快，腫瘤的發(fā)生率越高。

三、RCC干細胞及其表面標志

1989年Bander等[15]應用單克隆抗體探針進一步研究RCC細胞起源，發(fā)現(xiàn)在RCC中，部分細胞表型和正常胎兒近端腎小管祖細胞表型一致，表達相同的抗原。Gomella等[16]發(fā)現(xiàn)部分RCC細胞和胚胎時期的腎臟細胞均產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化生長因子-α，而正常成熟腎臟細胞則停止產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-α。根據(jù)以上結(jié)果可推斷，RCC細胞中部分細胞的特性與胚胎時期腎臟部分細胞極為相似，提示了RCC干細胞的存在可能。RCC主要由具有致癌性能的RCC干細胞和無致癌性能的其他細胞組成，RCC干細胞很可能是RCC的種子細胞，可能來源于近端腎小管祖細胞等腎臟干細胞。隨后人們對RCC干細胞的分離鑒定進行了大量的研究。

所有腫瘤細胞都有獨特的標記存在于表面，利用腫瘤細胞表面的蛋白標志物及特異的抗體，采用免疫磁珠等技術(shù)就能將表型特異的腫瘤細胞分離出來[17]。通常用的方法有表型標記篩選法、側(cè)亞群細胞（side population, SP）分選法和微球體培養(yǎng)分離CSCs[18]。SP分選法又稱為Hoechst33342染料排斥法，Hoechst33342是一種DNA增補性染料，能結(jié)合到DNA的AT豐富系列的小溝處，干細胞及CSCs因帶有ABC轉(zhuǎn)運蛋白而能將染料泵出而表現(xiàn)為染料暗淡的特征而被分離出來，所分選出來的染色暗淡的細胞被稱為SP細胞。已經(jīng)證實，在非附著培養(yǎng)條件下，以多細胞球或者球形細胞聚集體方式形成集落的能力是許多具有自我更新能力細胞的一種特點。這些細胞球可以被打散并且多次傳代，仍然保留形成球體的能力。體外球體形成試驗已被用于研究乳腺CSCs[19]和腦CSCs[20]。利用這些方法，2005年Florek等[21]從RCC中發(fā)現(xiàn)RCC干細胞的存在。潘鵬等[22]通過無血清培養(yǎng)的方法提取了RCC干細胞。基于目前分選方法的限制，研究熱點仍在如何確定RCC干細胞的表面標志物。主要是Oct-4、CD133+、ABCG2及BMI-1基因等與RCC干細胞之間的關(guān)系。

（一）Oct-4

Oct-4是由POU5Fl基因編碼產(chǎn)生的[23]，定位于染色體6p21.3，其編碼的蛋白是一種POU轉(zhuǎn)錄因子，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。Oct-4在全能性胚胎細胞中表達，被認為是ESCs保持自我更新、維持未分化狀態(tài)的主要調(diào)控因子。Oct-4通常被認為是ESCs的標記物，是一種在ESCs和精原細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，并且是調(diào)控和維持其多能性所必須的，它在腫瘤的發(fā)生增殖及分化過程中扮演重要的角色。Oct-4作為一種ESCs轉(zhuǎn)錄因子，它在泌尿系腫瘤中的表達提示在這些腫瘤中存在CSCs。Looijenga等[24]對包括100種以上不同類型腫瘤及3600例癌的多腫瘤組織微陣列分析表明Oct-4在RCC、精原細胞瘤/無性細胞瘤、胚胎性癌及它們的原位癌前體／性腺母細胞瘤中呈陽性表達。朱朝輝等[25]對27例RCC標本采用IHC和RT-PCR法進行檢測，發(fā)現(xiàn)Oct-4在絕大多數(shù)(25/27)的RCC標本中呈陽性表達，正常腎皮質(zhì)組織和癌旁組織中未檢測到Oct-4表達。Oct-4在RCC組織中的表達，說明了RCC中存在干細胞性質(zhì)的腫瘤細胞，而是否為RCC干細胞還需要更多的證據(jù)支持，更多的研究從RCC中分離RCC干細胞并描述它的特點，闡明Oct-4在RCC發(fā)生中的作用。

（二）CD133+

CD133+是一種分子量為120kDa具有5個跨膜區(qū)的蛋白，是一種早期抗原。最初該蛋白被命名為AC133+，屬于Prominin家族成員。2000年，在英國舉行的第七屆國際人類白細胞分化抗原研討會上被正式命名為CD133+?，F(xiàn)在CD133+分子已經(jīng)成為造血干/祖細胞（haematopoietic stem and progenitor cell, HSPC）的特征性表面標志。CD133+分子存在于正常干細胞的表面，是干細胞特征性的分子，可富集在包括ESCs在內(nèi)的不同干細胞[26]。目前CD133+在實體瘤CSCs的研究中日益顯示出其重要作用。腦腫瘤細胞表面CD133+可作為篩選CSCs的特征性標志[27]；CD133+能和其他表面標志共同作為篩選前列腺癌干細胞的標志[28]。然而CD133+是否也存在于腎臟及RCC中有待研究，?Florek等[21]從RCC中發(fā)現(xiàn)存在CD133+具有CSCs特性的細胞。翟羽佳等[29]及潘鵬等[22]也證實RCC中存CDl33+具有CSCs特性的細胞，而在正常腎組織細胞未測出有CD133+的表達。大量研究證實CD133+可能作為RCC干細胞的表面標志。

（三）ABCG2

ABCG2基因定位于人類染色體的4q22-q23，大小為67171bp，其基因的表達產(chǎn)物是有655個氨基酸組成的膜轉(zhuǎn)運蛋白，具有6個跨膜區(qū)和1個核結(jié)合區(qū)[30]。它作為一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，能把許多藥物排出細胞外，因此在腫瘤耐藥中起著至關(guān)重要的作用[31]。ABCG2是首先在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的一種參與腫瘤細胞耐藥的物質(zhì)，是位于細胞膜上的耐藥相關(guān)半轉(zhuǎn)運蛋白，與P糖蛋白和多耐藥相關(guān)蛋白同屬ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族，最早被定義為多耐藥轉(zhuǎn)運蛋白[32]，也稱為Bcrpl。楊保旺等[33]證實ABCG2在RCC組織中表達較高，其可能參加了RCC的發(fā)生和發(fā)展。RCC的一個顯著特點就是對化療極不敏感，而側(cè)群干細胞的標志物ABCG2的主要作用恰恰就是把包括化療藥物在內(nèi)的藥物泵出細胞外，使化療藥物不能起作用，使腫瘤耐藥。由此可以推測側(cè)群干細胞標記物ABCG2在RCC的耐藥中可能起著關(guān)鍵的作用。所以ABCG2很有可能也是RCC干細胞的表面標志物。

（四）BMI-1基因

BMI-1基因是干細胞在各種不同組織中生存必不可少的基因，其具有促進干細胞自我更新，抑制細胞周期蛋白激酶抑制基因p16Ink4a表達的功能。Al-Awqati等[5]于2002年已經(jīng)提出了RCC干細胞的假設，并認為RCC干細胞與BMI-1表達陽性的血液系統(tǒng)及實體CSCs有相似性，但是關(guān)于這一假設暫無確切證據(jù)。2006年，Lju等[34]提出了BMI-1的表達與CSCs的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此有理由根據(jù)BMI-1的表達鑒別RCC干細胞。Kozakowski等[35]研究顯示BMI-1更像是一個判斷腫瘤分化程度的標記物。至此關(guān)于BMI-1與RCC干細胞的關(guān)系尚無定論。

四、以CSCs為靶點的靶向治療

CSCs有很強的自我更新能力，且處于靜止狀態(tài)、有效的DNA修復、高表達多藥耐藥型膜轉(zhuǎn)運蛋白以及缺氧微環(huán)境等特性使其能夠抵抗常規(guī)的放射和化學治療。那么徹底治愈腫瘤唯一有效的方法就要針對CSCs群。

目前腫瘤靶向治療的方法有：(1)以CSCs的表面標記物為靶點，通過基因表達分析尋找CSCs特異表達抗原，首先在血液系統(tǒng)疾病中取得突破性進展，使用抗一種CSCs標志物CD44的抗體，清除了接種AML的免疫缺陷小鼠體內(nèi)的AML干細胞[36]；(2)促進CSCs分化，在實體瘤上也有可能應用分化誘導治療的方法，人們發(fā)現(xiàn)在體外骨形成蛋白4(bone morphogenic protein, BMP4)能降低絲裂原的增殖作用，減少CD133+細胞數(shù)量，使CD133+細胞喪失在體內(nèi)形成腫瘤的能力，體內(nèi)應用BMP4可縮小接種瘤體積，延長生存期，這提BMP4可以通過誘導CSCs分化發(fā)揮抑制腫瘤的作用[37]；（3）針對CSCs自我更新及靜止狀態(tài)，如BMI-1基因為維持CSCs自我更新的信號通路，這也使得BMI-1基因可能成為去除CSCs的靶點；（4）?CSCs生存所需的微環(huán)境，以CSCs生存所需的微環(huán)境為靶點成為腫瘤治療的又一種選擇，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以腦腫瘤起始細胞的血管微環(huán)境為靶點的治療可以減少腫瘤起始細胞的數(shù)量，終止腫瘤生長。然而，即使將這些通路作為靶點仍可能是不夠的，一種理想的藥物應當選擇性地濃集于CSCs而非正常干細胞。如果缺乏選擇性，療效將可能會受限于全身毒性。

五、結(jié)論

針對RCC對放、化療均不敏感且術(shù)后易復發(fā)、轉(zhuǎn)移，預后不佳的特性，RCC干細胞概念的提出為RCC發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的機制提供了全新的視角。RCC治療的模式可能將從單純殺傷腫瘤細胞群向靶向治療RCC干細胞轉(zhuǎn)變。研究RCC干細胞與腎臟正常細胞蛋白或基因表達的差異、信號轉(zhuǎn)導通路的差異、表面標志的差異，選擇性地對這些細胞進行干預，可為RCC的治療開辟新的途徑。RCC的異質(zhì)性決定了腫瘤組織中僅存在小部分的CSCs對化療、免疫治療產(chǎn)生持續(xù)的內(nèi)在耐藥性。RCC靶向治療的關(guān)鍵是以RCC干細胞為治療靶點。而RCC干細胞可能表達表面標志物CD133+、ABCG2等，但目前暫未找到特異性的靶向治療標志物，針對RCC干細胞自我增殖信號傳導通路和細胞周期基因或蛋白的阻滯劑可能給RCC的治療帶來新的希望。RCC干細胞的研究很重要，研究其發(fā)生、發(fā)展規(guī)律并加以消滅，是根治腫瘤及防止其復發(fā)、轉(zhuǎn)移的一條重要途徑。RCC干細胞的研究目前還處于起步階段。當前的研究還需解決如下問題：尋找RCC干細胞更精確而特異的表型；分離RCC干細胞而不傷及正常干細胞；研究RCC干細胞的微環(huán)境，明確RCC干細胞自我更新，不對稱分裂和維持周圍微環(huán)境的分子機制；篩選RCC干細胞靶向治療的藥物。這些問題的解決將極大提高RCC診治水平。

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