王傳禹，常志順，楊 斌，楊向東

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224;2.昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司，云南 昆明 650215)

雞大腸桿菌病是由某些致病血清型或條件性致病大腸桿菌引起的不同疾病的總稱，在集約化雞場(chǎng)已成為危害雞群的主要疾病之一。臨床上表現(xiàn)為敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、全眼球炎、腦炎等，發(fā)病率高，死亡率高，且因與其它呼吸道疾病(如慢性呼吸道疾病)混合或繼發(fā)感染而使死亡率升高。在產(chǎn)蛋母雞，可發(fā)生腹腔內(nèi)的大腸桿菌感染，發(fā)展成為卵黃性腹膜炎。

2011年7月，昆明某蛋雞場(chǎng)羅曼褐育成雞4 500只，產(chǎn)蛋雞4 200只，相繼發(fā)生以下痢、呼吸困難、眼球炎和產(chǎn)蛋率下降為特征的疾病。育成雞從60日齡開始陸續(xù)發(fā)病，病雞精神萎頓，多數(shù)出現(xiàn)呼吸困難，有啰音，腹瀉，糞便呈灰綠色，腳軟，站立不穩(wěn)，部分眼瞼腫脹，角膜混濁，最后失明，3～7 d死亡，病死率約為9%;產(chǎn)蛋雞從210日齡開始陸續(xù)發(fā)病，產(chǎn)蛋率迅速下降5%，病雞多精神沉郁，食欲減退，腹部膨大，糞便灰綠色或黃色，多經(jīng)1～2周死亡，病死率約為3%。病死雞剖檢病理變化表現(xiàn)為典型的氣囊炎、肝周炎、心包炎，卵巢變形、卵泡破裂，腹腔內(nèi)充滿卵黃液并引起腹膜炎致使腸粘連，卵黃凝固，氣味惡臭。無菌采取病死雞肝臟等樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查，確定雞群為大腸桿菌感染。通過藥敏試驗(yàn)篩選出敏感藥物和利用大腸桿菌分離株制備自家滅活菌苗用于雞群的治療和預(yù)防，收到滿意的效果，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與防治情況報(bào)告如下。

1 細(xì)菌分離與鑒定

1.1 材料

1.1.1 病料

具有大腸桿菌病癥狀的病死雞和瀕死雞，剖檢采集肝臟組織及卵巢或卵黃、眼球液等組織作為細(xì)菌分離的材料。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片為杭州天和生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

購自昆明某雞場(chǎng)。

1.1.4 血清

禽大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O因子血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌操作取病死雞的肝臟、眼球液、卵黃等，劃線接種鮮血瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。選擇單個(gè)菌落接種普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板，符合大腸桿菌的生長特性時(shí)，在營養(yǎng)肉湯中增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18 h。

1.2.2 生化試驗(yàn)

取麥康凱瓊脂上磚紅色單個(gè)菌落接種細(xì)菌生化微量鑒定管，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

將分離的菌株，按常規(guī)紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其敏感性。

1.2.4 血清學(xué)試驗(yàn)

經(jīng)形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性檢查和生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌的，血清型鑒定按中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 致病性試驗(yàn)

將分離菌接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，采用比濁法測(cè)定細(xì)菌含量，調(diào)整菌數(shù)為1.0×108CFU/mL，皮下接種10日齡雛雞3只，每只0.5mL;并設(shè)對(duì)照組3只，皮下注射0.5mL無菌營養(yǎng)肉湯。接種后觀察72 h，記錄死亡情況，并取肝脾進(jìn)行細(xì)菌分離。對(duì)72 h后存活者剖殺，觀察病變并做細(xì)菌分離。

1.3 結(jié)果

1.3.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

先后共分離獲得14株符合大腸埃希氏菌特征的雞源大腸桿菌，病原菌在鮮血瓊脂平板上形成圓形隆起、濕潤的大菌落;在普通瓊脂平板上菌落為灰白色;在麥康凱瓊脂上形成磚紅色濕潤的菌落;在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色，具有金屬光澤的菌落;在普通肉湯中均勻混濁，管底有少量灰白色沉淀，有糞臭味。用革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陰性的小桿菌。分離株用15%甘油血清－70℃保存。

1.3.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

14株細(xì)菌能100%分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，不能分解肌醇，靛基質(zhì)、MR、硝酸鹽試驗(yàn)呈陽性，H2S、V－P、檸檬酸鹽試驗(yàn)呈陰性。

1.3.3 血清型鑒定結(jié)果

符合大腸桿菌特性的14株細(xì)菌純培養(yǎng)物與大腸桿菌O因子血清做凝集試驗(yàn)，鑒定出3種血清型，其中O78有4株、O161有2株、O4有1株，4株自凝、3株有待于進(jìn)一步的血清型鑒定。

1.3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

健康雛雞于接種后6 h普遍出現(xiàn)精神沉郁等癥狀，12 h后開始出現(xiàn)死亡，72 h內(nèi)各菌株死亡只數(shù)1～3只。死亡率平均66.7%。取死亡或?yàn)l死的雛雞進(jìn)行解剖取材，進(jìn)行細(xì)菌分離和生化鑒定，回收菌與接種菌一致;對(duì)照組健康存活無死亡，未見明顯的臨床癥狀及病變。說明分離菌是對(duì)雛雞有致病性的大腸埃希氏菌。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離株對(duì)丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星高度敏感，對(duì)慶大霉素、恩諾沙星、妥布霉素中度敏感，對(duì)頭孢氨芐、強(qiáng)力霉素、新霉素、青霉素、鏈霉素、紅霉素、阿莫西林、氯霉素、羅紅霉素不敏感。

2 大腸桿菌自家菌苗的制備與檢測(cè)

2.1 增菌培養(yǎng)與滅活

將O78、O161、O4血清型菌株純培養(yǎng)物分別接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，用甲醛生理鹽水洗下各型菌株瓊脂平板上菌苔，備用。取少量菌液做細(xì)菌計(jì)數(shù)，用蒸餾水調(diào)整各菌液濃度至50億/mL和120億/m L，甲醛終濃度為0.3%，將 O78、O161、O4株菌液按 4∶1∶1 的比例混合，37℃作用 24 h，每隔4 h搖勻一次。

2.2 菌苗制備

Al(OH)3膠佐劑菌苗:將50億/mL混合菌液按5∶1的比例加入滅菌處理過的鋁膠和0.01%硫柳汞，充分搖勻，37℃作用24 h;油佐劑滅活苗:在120億/mL混合菌液中加2%吐溫－80和0.04%硫柳汞搖勻，無菌檢驗(yàn)后制成水項(xiàng)，油項(xiàng)和水項(xiàng)按3∶1比例乳化制成油佐劑滅活苗。

2.3 無菌檢驗(yàn)

取滅活菌苗少量樣品分別接種瓊脂平板和肉湯，37℃培養(yǎng)過夜。平板無細(xì)菌生長，肉湯呈澄清狀態(tài)。說明甲醛滅活完全，無活菌檢驗(yàn)合格。

2.4 安全性檢驗(yàn)

取20只健康雞，10只肌肉注射鋁膠菌苗1mL/只，10只注射油佐劑滅活苗1mL/只，連續(xù)觀察3 d，雞無外觀癥狀，無病理變化。說明制備的自家菌苗是安全的。

3 防治措施

3.1 隔離與消毒

隔離弱、病雞，防止病原進(jìn)一步擴(kuò)散，及時(shí)清除病死雞并焚燒深埋，用含碘消毒液噴霧消毒1次/d，連用3 d。

3.2 治療

全群用氧氟沙星飲水，連用5 d，同時(shí)補(bǔ)充多種維生素進(jìn)行輔助治療。

3.3 菌苗接種

發(fā)病雞群用鋁膠佐劑菌苗+丁胺卡那霉素(10mg/kg)混勻，0.5mL/羽肌肉注射。育成雞群80～90日齡頸部皮下或肌肉注射油佐劑滅活疫苗，注射劑量為0.5mL/羽。

經(jīng)采取以上措施，用藥第2天病情好轉(zhuǎn)，病死雞數(shù)量明顯減少，5 d后雞群恢復(fù)正常。該批育成雞至產(chǎn)蛋高峰未出現(xiàn)患大腸桿菌的病死雞。

4 小結(jié)與討論

(1)本實(shí)驗(yàn)對(duì)雞場(chǎng)大腸桿菌的分離培養(yǎng)、生化特性、藥敏試驗(yàn)、血清學(xué)鑒定、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等做了系列研究，并對(duì)鑒定的大腸桿菌進(jìn)行了增菌培養(yǎng)、活菌計(jì)數(shù)、甲醛滅活，制備了Al(OH)3膠佐劑菌苗和油佐劑滅活苗，對(duì)疫苗進(jìn)行無活菌和安全性檢驗(yàn)。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果用藥和接種自家滅活疫苗來治療及防制該場(chǎng)的大腸桿菌病，取得了良好的效果。再次證明規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)疾病的診療通過實(shí)驗(yàn)室檢查，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用于臨床和生產(chǎn)，能最經(jīng)濟(jì)最有效地治療和控制疾病。

(2)由于抗生素的不合理使用及大腸桿菌耐藥質(zhì)粒和菌株本身的變異，導(dǎo)致了抗生素防治雞大腸桿菌病的局限性。如不進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選用抗生素防治大腸桿菌具有很大的盲目性，效果不確定且成本較高。例如有的養(yǎng)殖場(chǎng)雞大腸桿菌對(duì)頭孢氨芐高度敏感，對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥，而該場(chǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果則恰好相反。在大腸桿菌污染嚴(yán)重的雞場(chǎng)，使用菌苗對(duì)該病進(jìn)行生物防治，也存在著一定的局限性，這是由于大腸桿菌血清型很多，又極易產(chǎn)生變異，各地的菌株又不盡相同，相互間的免疫原性也有很大差異。因此，建議使用本場(chǎng)菌株制備的自家菌苗來預(yù)防雞的大腸桿菌病。

(3)大腸桿菌病是條件性疾病，只有加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、搞好環(huán)境衛(wèi)生、嚴(yán)格消毒，實(shí)時(shí)對(duì)致病性大腸桿菌的監(jiān)測(cè)、進(jìn)行藥物預(yù)防和疫苗接種等綜合防治措施的應(yīng)用才是減少或杜絕大腸桿菌病發(fā)生的根本方法。