馮俊強(qiáng)， 張立志， 楊 光綜述， 江新梅審校

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病(neurological degenerative diseases)。變性疾病大部分是異質(zhì)性的，而基因突變造成神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白表達(dá)和聚集卻常常是共性的。如阿爾茨海默病時的β樣淀粉樣蛋白變性及微管相關(guān)蛋白(tau)病理即為老年斑及神經(jīng)原纖維纏結(jié)主要組成成分即淀粉樣原纖維蛋白聚集物［1］，路易體(Lewy)中的a-共核蛋白也是構(gòu)成帕金森病的病理基礎(chǔ)。近來神經(jīng)病理學(xué)發(fā)現(xiàn):在額葉變性時出現(xiàn)的泛素包涵體(ubiquitin inclusion，UBI)［2］，在 ALS 中也存在［3］。這些異常的蛋白聚集物(包涵體)已經(jīng)成為了疾病的特異性標(biāo)志，甚至也是疾病的成因。

2006年，Virginia Lee等發(fā)現(xiàn):在肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)及額顳葉癡呆(FTLD)患者的病理性包涵體中檢測到TDP-43(trans active response DNA bind ing protein gene分子量為43千道爾頓的具有免疫活性/反應(yīng)性的DNA結(jié)合蛋白)。病理性的TDP-43是一種高磷酸化泛素，其羧基末端只影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括海馬、大腦皮質(zhì)和脊髓。常見于各種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］。而TDP-43發(fā)現(xiàn)于1995年，該蛋白曾是囊腫性纖維化和HIV領(lǐng)域的研究內(nèi)容。

1 TDP-43的概念及生理功能

TDP-43是由414個氨基酸構(gòu)成的核蛋白，是由1號常染色體的TARDBP(trans active response DNA-binding protein gene)基因編碼的。因其分子量為43 kDa，故被命名為TDP-43。最初發(fā)現(xiàn)其在HIV病毒體內(nèi)的基因組所復(fù)制，是一種與TAR-DNA相結(jié)合的起到抑制轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞因子［5］。在所有組織中(包括腦組織)呈高度保守及泛素化表達(dá)［6，7］。該蛋白含有兩個RNA識別序列，在C末端富含甘氨酸。此蛋白是囊性纖維病跨膜調(diào)節(jié)因子及載脂蛋白A2調(diào)節(jié)因子復(fù)合物［8］，在TDP-43中富含甘氨酸的C末端的區(qū)域發(fā)揮針對外顯子的跳躍及拼接的抑制活性［9，10］，而且在 TDP-43中富含甘氨酸的C末端可與多種不同類別的核蛋白即異質(zhì)性的核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)進(jìn)行結(jié)合，并與mRNA生成有關(guān)［10］。最近又發(fā)現(xiàn)，在小鼠的TDP-43可與其臨近的SP-10基因(acrosomal vesicle protein 1)啟動子結(jié)合，參與并調(diào)節(jié)精子的生成［11］。另外，在發(fā)生ALS患者的殘存運(yùn)動神經(jīng)元中TDP-43可以在其核小體中起到支架作用［12］。正常情況下，TDP-43在胞漿內(nèi)合成后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒於€(wěn)定的多肽，成熟的TDP-43將會有大部分轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi)，與TAR DNA結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接、參與mRNA的修飾等作用，并起到穩(wěn)定mRNA的作用，而留在胞漿中的TDP-43含量甚微。在生理狀態(tài)下，TDP-43多肽經(jīng)歷翻譯后修飾，包括磷酸化和泛素化，在發(fā)揮完其生理功能后便通過蛋白酶體通路被降解。

2 ALS中的TDP-43

2.1 TDP-43與肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)Virginia Lee等研究證明:在對泛素陽性 FTLD［13～17］和 ALS［15，18，19］等疾病時包括神經(jīng)元胞漿、變性軸突、神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)包涵體等的研究發(fā)現(xiàn)，其中均含有異常的TDP-43，這些TDP-43蛋白在胞漿中異常聚集(正常情況下胞漿中含量甚微)，形成類似球形的包涵體，對其進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)其是一種特異且敏感的檢測指標(biāo)。需要指出，在健康的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的生理性TDP-43也可以被檢測出，而在病理狀態(tài)下，正常神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的TDP-43的表達(dá)量顯著減少(生理狀態(tài)下僅在核內(nèi)發(fā)揮作用)，而轉(zhuǎn)為胞漿中異常聚集。由于原有的效應(yīng)含量明顯下降，所以在ALS時TDP-43的正常生理功能極有可能是被大大的減損了。需要指出，這些病理性的包涵體同樣也呈現(xiàn)泛素化陽性，即在ALS及諸多亞型中的病理性包涵體可同時表現(xiàn)為泛素化陽性及TPD-43陽性。另外，在ALS及其諸多亞型病變中早期無法進(jìn)行鑒定時，也可以通過對其膠質(zhì)細(xì)胞中的包涵體進(jìn)行TDP-43的免疫組化技術(shù)進(jìn)行鑒定，以幫助早期診斷病變［15，19，20］。在伴或不伴有癡呆的ALS患者的受累腦組織神經(jīng)元胞漿及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)檢測到的TDP-43包涵體多呈類球形。大部分ALS病例為散發(fā)型病例，僅有大約10%左右為家族型。家族型的ALS在發(fā)病的病因上是呈現(xiàn)異質(zhì)性的，其中約20%是SOD1突變造成的，為常染色體顯性遺傳［21］。由于在非超氧化物歧化酶基因突變的家族性ALS的患者中，其病理性TDP-43蛋白是明確存在的;而在以SOD1基因突變?yōu)椴∫虻囊恍┗颊咧?，其UBI(泛素陽性包涵體)中沒有檢測到 TDP-43［18，19］，這與SOD1基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中沒有檢測到TDP-43這一結(jié)論是相符合的［22］，所以有人認(rèn)為TARDBP突變導(dǎo)致的病理性的TDP-43是非超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變的家族型ALS的候補(bǔ)基因。另外，在西太平洋島嶼中的查莫羅人所患的關(guān)島型ALS及以大量tau蛋白為病理表現(xiàn)的帕金森-癡呆癥的患者脊髓中檢測到了TDP-43［23］，在這些患者中的大腦皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)中也檢測到了TDP-43［23，24］。這也進(jìn)一步提示了病理性TDP-43途徑是完全不同于SOD1基因突變的一類新的發(fā)病途徑，當(dāng)然，這一結(jié)論也尚存爭議［25］。

2.2 ALS中的TDP-43病理表現(xiàn) Piao等［26］對102例ALS剖檢:發(fā)現(xiàn)全部病例的脊髓前前角細(xì)胞胞漿中均有包涵體。針對該包涵體進(jìn)行TDP-43免疫組化染色發(fā)現(xiàn)其全部呈現(xiàn)陽性。日本弘前大學(xué)神經(jīng)病理學(xué)者［27］對20例ALS患者(其中6例為伴癡呆的ALS，即ALS-D)的皮質(zhì)、皮質(zhì)下、新紋狀體、邊緣系統(tǒng)、顳葉、脊髓等神經(jīng)組織進(jìn)行了TDP-43的免疫組化研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn):在患者的運(yùn)動神經(jīng)元、額顳葉淺部皮質(zhì)、新紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)、丘腦等處均有泛素陽性包涵體，其TDP-43也呈陽性反應(yīng)。在針對皮質(zhì)、新紋狀體、黑質(zhì)等的神經(jīng)組織進(jìn)行的HE染色、單/多克隆TDP-43抗體雙重免疫組化染色發(fā)現(xiàn):(1)新紋狀體變性程度較皮質(zhì)、黑質(zhì)的神經(jīng)變性輕微;(2)顳葉、黑質(zhì)的神經(jīng)元丟失多見于伴有癡呆的ALS(ALS-D)，新紋狀體神經(jīng)元丟失并不顯著;(3)所有神經(jīng)組織包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均呈TDP-43陽性反應(yīng)，其中尤以多克隆TDP-43抗體的陽性反應(yīng)比例高，反應(yīng)陽性的包涵體位于胞漿中。(4)在ALS-D患者中其TDP-43陽性率高于普通型ALS。(5)包涵體形態(tài)分為:大神經(jīng)元中的枝芽狀(見圖1)及多形狀兩種包涵體(見圖2)，小神經(jīng)元中的新月形(見圖3)或環(huán)狀(見圖4)兩種包涵體。而其中大神經(jīng)元中的枝芽狀包涵體僅呈泛素陽性反應(yīng)，TDP-43呈陰性。以上包涵體圍繞細(xì)胞核分布或在胞核附近分布。(6)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的TDP-43包涵體仍然呈類似表現(xiàn)(見圖5～圖7)。

圖1 新紋狀體大神經(jīng)元泛素陽性包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖2 新紋狀體大神經(jīng)元TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖3 新紋狀體小神經(jīng)元TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖4 新紋狀體小神經(jīng)元TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖5 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖6 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

圖7 新紋狀體神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞TDP-43包涵體(標(biāo)尺5μm)

2.3 病理性TDP-43的分子生物學(xué) 由于在伴癡呆的ALS患者中發(fā)現(xiàn)了病理性的TDP-43，并且存在于ALS和FTLD-U時的泛素陽性包涵體(UBI)中，TDP-43是二者共有的、相互交織的，在造成神經(jīng)變性方面起到了同一角色作用。時至今日，TARDBP基因變異已經(jīng)引人關(guān)注［28］。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TDP-43的功能是抑制轉(zhuǎn)錄及剪接控制因子［5～7］，但是，這種蛋白裝置是如何引起神經(jīng)系統(tǒng)變性的，目前還尚不清楚。至2008年，被鑒定出的TARDBP基因的突變體有多達(dá)15種，該基因編碼TDP-43，與FTLD-U、家族性和散發(fā)ALS患者中神經(jīng)組織異常蛋白增長有關(guān)［29］。諸如:密碼子290的甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Ala)取代和密碼子298的甘氨酸(Gly)被絲氨酸(Ser)取代，而這一區(qū)域是TDP-43中富含甘氨酸的區(qū)域，此區(qū)恰恰具有調(diào)控基因表達(dá)和調(diào)節(jié)核蛋白之間的作用功能。又如TARDBP基因外顯子6的突變，密碼子315的丙氨酸(Ala)被蘇氨酸(Thr)替代、密碼子337的甲硫氨酸(Met)被纈氨酸(Val)替代，這種病變在兩個家系中被鑒定出來，另外，在一些散發(fā)ALS患者中的331號密碼子谷氨酰胺(Gln)被賴氨酸(Lys)替代、密碼子294甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Ala)替代［30］。基于此，就形成了一些假說。由于氨基酸被異常的替換，原有結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞或功能發(fā)生錯誤改變等，使得在包涵體中的TDP-43多價螯合，發(fā)生功能缺失，所以造成了轉(zhuǎn)錄起始階段的mRNA出現(xiàn)了異常轉(zhuǎn)錄和拼接紊亂。正常情況下TDP-43是一種穩(wěn)定的低分子量的神經(jīng)微絲mRNA結(jié)合蛋白，與3’UTR(不翻譯區(qū))相互作用［31］，而在ALS患者中，發(fā)現(xiàn)其活性丟失，成為了不穩(wěn)定的低分子量神經(jīng)微絲mRNA結(jié)合蛋白，其亞基上的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，造成了神經(jīng)微絲的聚集而發(fā)病。另外，TDP-43的多價螯合，也會導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元存活基因(SMN)及核內(nèi)不均一核糖核蛋白(hnRNP)在細(xì)胞內(nèi)的正常分布發(fā)生改變，但是這種表達(dá)的改變及hnRNP的翻譯后修飾的改變在FTLD-U和ALS中并沒有被觀察到，并且在UBI中也沒有檢測到hnRNP［32］。此外，包涵體中TDP-43與剪接控制功能有關(guān)的C末端發(fā)生聚集后，使其正常的生物學(xué)活性發(fā)生紊亂，也會引起發(fā)病，此過程被認(rèn)為毒性獲得功能。另外也有人認(rèn)為PGRN基因編碼TDP-43的配體蛋白，與 TDP-43的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［33］。在PGRN的功能失調(diào)或異常就可導(dǎo)致TDP-43的異常分布。最后，由于TDP-43的異常磷酸化，將導(dǎo)致其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的斷裂或直接造成TDP-43自身的運(yùn)輸障礙，因此引發(fā)神經(jīng)功能障礙。目前，由于鼠模型的建立及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，正逐步驗(yàn)證上訴假說并闡明TDP-43在ALS及FTLD-U的發(fā)病機(jī)制中所起的作用。

［1］Forman MS，Trojanowski JQ，Lee VM.Neurodegenerative diseases:a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs［J］.Nat Med，2004，10(10):1055 －1063.

［2］Kumar-Singh S，Van Broeckhoven C.Frontotemporal lobar degeneration:current concepts in the light of recent advances［J］.Brain Pathol，2007，17(1):104 － 114.

［3］Xiao S，McLean J，Robertson J.Neuronal intermediate filaments and ALS:a new look at an old question［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1762(11－12):1001－1012.

［4］Neumann M，Sampathu DM，Kwong LK，et al.Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis［J］.Science，2006，314(5796):130 －133.

［5］Forman MS，Trojanowski JQ，Lee VM.TDP-43:a novel neurodegenerative proteinopathy［J］.Curr Opin Neurobiol，2007，17(5):548 －555.

［6］Buratti E，Baralle FE.Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43，a novel splicing regulator of CFTR exon 9［J］.Biol Chem，2001，276(39):36337 －36343.

［7］Ayala YM，Pantano S，D’Ambrogio A，et al.Human，Drosophila and C.elegans TDP-43:nucleic acid binding properties and splicing regulatory fun ction［J］.Mol Biol，2005，348(3):575 － 588.

［8］Mercado PA，Ayala YM，Romano M，et al.Depletion of TDP-43 overrides the need for exonic and intronic splicing enhancers in the human apoA-II gene［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(18):6000 －6010.

［9］Wang HY，Wang IF，Bose J，et al.Structural diversity and functional implications of the eukaryotic TDP gene family［J］.Genomics，2004，83(1):130－139.

［10］Buratti E，Brindisi A，Giombi M，et al.TDP-43 binds heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B through its C-terminal tail:an important region for the inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator exon 9 splicing［J］.Biol Chem，2005，280(45):37572－37584.

［11］Acharya KK，Govind CK，Shore AN，et al.cis-Requirement for the maintenance of round spermatid-specific transcription［J］.Dev Biol，2006，295(2):781 － 790.

［12］Wang IF，Reddy NM，Shen CK.Higher order arrangement of the eukaryotic nuclear bodies［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(21):13583－13588.

［13］Cairns NJ，Neumann M，Bigio EH，et al.TDP-43 in familial and sporadic frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin inclusions［J］.Am J Pathol，2007，171(1):227 －240.

［14］Davidson Y，Kelley T，Mackenzie IR，et al.Ubiquitinated pathological lesions in frontotemporal lobar degeneration contain the TAR DNA-binding protein，TDP-43［J］.Acta Neuropathol，2007，113(5):521－533.

［15］Arai T，Hasegawa M，Akiyama H，et al.TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，351(3):602 －611.

［16］Seelaar H，Schelhaas HJ，Azmani A，et al.TDP-43 pathology in familial frontotemporal dementia and motor neuron disease without Progranulin mutations［J］.Brain，2007，130(5):1375 －1385.

［17］Higashi S，Iseki E，Yamamoto R，et al.Appearance pattern of TDP-43 in Japanese frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions［J］.Neurosci Lett，2007，419(3):213 － 218.

［18］Tan CF，Eguchi H，Tagawa A，et al.TDP-43 immunoreactivity in neuronal inclusions in familial amyotrophic lateral sclerosis with or without SOD1 gene mutation［J］.Acta Neuropathol，2007，113(5):535－542.

［19］Mackenzie IR，Bigio EH，Ince PG，et al.Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutations［J］.Ann Neurol，2007，61:427 －434.

［20］Neumann M，Mackenzie IR，Cairns NJ，et al.TDP-43 in the ubiquitin pathology of frontotemporal dementia with VCP gene mutations［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2007，66(2):152 －157.

［21］Gros-Louis F，Gaspar C，Rouleau GA.Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1762(11-12):956 －972.

［22］Robertson J，Sanelli T，Xiao S，et al.Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS［J］.Neurosci Lett，2007，420(2):128 －132.

［23］Geser F，Winton MJ，Kwong LK，et al.Pathological TDP-43 in parkinsonism-dementia complex and amyotrophic lateral sclerosis of Guam［J］.Acta Neuropathol，2008，115(1):133 －145.

［24］Hasegawa M，Arai T，Akiyama H，et al.TDP-43 is deposited in the Guam parkinsonism-dementia complex brains［J］.Brain，2007，130(5):1386－1394.

［25］Rothstein JD.TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis:pathophysiology or patho-babel［J］?Ann Neurol，2007，61(5):382-384.

［26］Piao YS，Wakabayashi K，Kakita A，et al.Neuropathology with clinical correlations of sporadic amyotrophic lateral sclerosis 102 autopsy cases examined between 1962 and 2000［J］.Brain Pathol，2003，13(1):10－22.

［27］Zhang HX，Tan CF，Mori F，et al.TDP-43-immunoreactive neuronal and glial inclusions in the neostriatum in amyotrophic lateral sclerosis with and without dementia［J］.Acta Neuropathol，2008，115(1):115－122.

［28］Rollinson S，Snowden JS，Neary D，et al.TDP-43 gene analysis in frontotemporal lobar degeneration［J］.Neurosci Lett，2007，419(1):1－4.

［29］Sreedharan J，Blair IP，Tripathi VB，et al.TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis［J］.Science，2008，319(5870):1668－1672.

［30］Van Deerlin VM，Leverenz JB，Bekris LM，et al.TARDBP mutations in amyotrophic lateral sclerosis with TDP-43 neuropathology:a genetic and histopathological analysis［J］.Lancet Neurol，2008，7(5):409－416.

［31］Strong MJ，Volkening K，Hammond R，et al.TDP43 is a human low molecular weight neurofilament(hNFL)mRNA-binding protein［J］.Mol Cell Neurosci，2007，35(2):320 －327.

［32］Neumann M，Igaz LM，Kwong LK，et al.Absence of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins and survival motor neuron protein in TDP-43 positive inclusions in frontotemporal lobar degeneration［J］.Acta Neuropathol(Berl)，2007，113(5):543 －548.

［33］Ahmed Z，Mackenzie IR，Hutton ML，et al.Progranulin in frontotemporal lobar degeneration and neuroinflammation［J］.J Neuroinflammation，2007，4:7.