施維松，陳瑞愛，張曉楠，詹烜子，唐兆新

（1.廣東省獸用生物制品生物工程技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點實驗室，廣東 肇慶 526238；2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東 肇慶 526238）

禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，是危害禽類健康的重要傳染病之一。該病給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，同時也對人類健康帶來嚴(yán)重威脅。AI的防控研究具有重要的經(jīng)濟學(xué)和公共衛(wèi)生意義。

疫苗免疫是我國AI防控禽流感傳播的重要途徑。我國從20世紀(jì)90年代開始禽流感病毒（AIV）滅活疫苗研究，其中H5N1亞型重組病毒株的AIV滅活疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用，具有良好的免疫效果，在H5N1亞型禽流感的防控中起到了重要的作用。國內(nèi)的禽流感滅活疫苗的生產(chǎn)工藝中，滅活過程都是使用甲醛溶液作為滅活劑，其滅活能達到很好的效果，但是甲醛滅活不僅滅活了病毒也破壞了病原體的免疫原性，并且甲醛滅活時間比較長，易受溫度、pH值、濃度、是否存在有機物、病原體的種類和含氮量等因素影響，殘留的游離甲醛，若隨疫苗注入機體后，會產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)。所以需要尋找更加安全可靠的滅活劑進行病毒的滅活。BEI是一種烷化劑，對病毒具有很強的滅活作用，其作用原理是破壞微生物核酸，而不影響其蛋白質(zhì)成分，并保持病毒抗原性［1-2］。本試驗通過使用不同終濃度的BEI和不同的滅活時間、溫度對AIV進行滅活，確定BEI的滅活條件，并制備疫苗進行免疫試驗，結(jié)果表明，該滅活苗安全、可靠，其免疫原性明顯優(yōu)于甲醛滅活疫苗。

1 材料與方法

1.1 抗原 禽流感H5N1亞型（Re-5株）抗原由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司生產(chǎn)；禽流感H5N1亞型（Re-5株）診斷抗原，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 試驗動物與雞胚 3～4周齡SPF雞及10日齡雞胚，均購自新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實驗動物中心。

1.3 主要試劑 二乙烯亞胺（BEI），購自TCI公司；硫代硫酸鈉，購自 Alfa公司；PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit、RNAiso plus總 RNA提取試劑、dNTP和Ex Taq，均購自TaKaRa公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.4 BEI的配制 用0.2mol／L NaOH溶液配制濃度為0.1mol／L BEI溶液［3］。

1.5 抗原滅活 在負(fù)壓生產(chǎn)區(qū)，根據(jù)病毒液的量分別加入終濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的BEI，至于37℃恒溫?fù)u床中（120r／min），分別滅活1，2，4，8，12，18，24h后，加 BEI用量10%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。

1.6 滅活效果檢測 滅后樣品按照生產(chǎn)規(guī)程滅活檢驗要求接SPF雞胚，孵育后72h檢測血凝價，并盲傳一代，檢測血凝價。

1.7 血凝（HA）試驗 取滅活前后的病毒液，按照中國獸藥典紅細胞凝集試驗（CVP3／2010／FL／010）分別測定HA。

1.8 滅后病毒完整性 常規(guī)方法擴增病毒，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)GenBank AIV核苷酸序列設(shè)計并合成HA引物，上游引物：5′-aaaatggagagaatagtgctt-3′，下 游 引 物：5′-ctacaatctgaactcaataaat-3′，HA基因片段總長度為1720bp。

1.9 BEI滅活疫苗制備 按照規(guī)程規(guī)定，油水比例2∶1進行乳化，分裝備用。

1.10 BEI滅活疫苗安全性檢驗 60羽SPF雞隨機分為6組，每組10羽，其中1、2、3、4、5組用5批BEI滅活疫苗安全性評價，每羽雞胸部肌肉注射2 mL。6組空白對照組，不接種。

1.11 BEI滅活疫苗效力試驗 110羽SPF雞隨機分為11組，每組10羽，1～5組用于5批BEI（0.5%）滅活疫苗免疫接種，6～10組用于對應(yīng)的甲醛（0.2%）滅活對照組疫苗的免疫接種，11組作為空白對照組，比較BEI滅活疫苗的免疫效果。每羽雞胸部肌肉注射0.3mL，免疫后14d、21d逐羽采血分離血清，進行HI抗體檢測。

2 結(jié)果

2.1 BEI滅活抗原結(jié)果 不同濃度BEI 37℃滅活抗原不同時間點取樣，進行滅活效果檢測，結(jié)果BEI終濃度≥0.5%，病毒能夠完全滅活，重復(fù)3次結(jié)果保持一致（見表1）。

表1 不同濃度BEI滅活禽流感病毒結(jié)果

2.2 血凝試驗結(jié)果 病毒液滅活前平均HA價為8.4log2，滅活后平均HA價為8.4log2，表明BEI在滅活前后對AIV的效價無影響（見表2）。

表2 滅活前后HA價結(jié)果

2.3 病毒完整性檢測結(jié)果 通過設(shè)計的HA引物對病毒滅活前后提取的總RNA進行檢測，終濃度0.5%的BEI在37℃滅活病毒24h后，5批樣品均擴增不到目的條帶（見圖1）；該結(jié)果與滅活效果結(jié)果一致，表明在這些條件下病毒已經(jīng)被滅活。

2.4 BEI滅活疫苗安全性試驗結(jié)果 觀察至免疫后14d，各試驗組雞只均健活，剖檢觀察疫苗吸收良好，未出現(xiàn)異常情況。

圖1 病毒滅活前后HA基因擴增結(jié)果

2.5 BEI滅活疫苗效力試驗結(jié)果 BEI滅活疫苗和對照疫苗免疫14d、21d后分別采血進行抗體水平檢測，結(jié)果BEI滅活疫苗免疫14d、21d的平均效價分別為7.27log2、8.35log2，同批抗原對照甲醛滅活疫苗免疫14d、21d的平均效價為6.33log2、7.66log2（見表3）。由試驗結(jié)果看出，禽流感病毒BEI滅活疫苗誘導(dǎo)雞只產(chǎn)生抗體的能力高于甲醛滅活疫苗。

3 討論

禽流感是對我國養(yǎng)禽業(yè)危害較大的疫病之一。預(yù)防該病主要采用禽流感滅活疫苗，傳統(tǒng)的AIV滅活方法是使用甲醛滅活，易使病毒表面融合蛋白抗原受到破壞，同時可能存在滅活病毒不徹底，免疫動物易發(fā)生感染現(xiàn)象［4］。BEI滅活疫苗的最大特點就是BEI破壞病毒的核酸，使病毒完全喪失感染力，而不損壞其蛋白質(zhì)衣殼，保留其保護性抗原，病毒的免疫原性幾乎不受破壞［5-6］。從實際應(yīng)用考慮，BEI滅活劑為瓶裝固體粉末，性質(zhì)穩(wěn)定，便于運輸和保存，同時配制簡單，滅活效果好，使用成本較低，適合于大生產(chǎn)應(yīng)用。本研究使用終濃度0.5%BEI能夠完全滅活禽流感病毒，由BEI滅活的禽流感病毒制成滅活疫苗對免疫動物安全，并且能保持良好的免疫原性，21d的免疫效價為8.35log2，同比的甲醛滅活疫苗免疫效價只有7.66log2，說明BEI滅活疫苗誘導(dǎo)雞只產(chǎn)生抗體的能力要優(yōu)于甲醛滅活疫苗。雖然研究已經(jīng)獲得了實驗室BEI滅活禽流感病毒的濃度和滅活時間，但還要在實際生產(chǎn)中對BEI滅活劑滅活禽流感病毒的濃度和時間進行深入的探討。

表3 BEI滅活疫苗免疫效果

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［2］徐守振 ，尹燕博 ，王新.動物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（9）：162-167.

［3］Habib Mudasser，Hussain Iftikhar，F(xiàn)ang ，et al.Inactivation of infectious bursal disease virus by binary ethylenimine and formaldehyde［J］.Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2006 ，7（4）：320-323.

［4］魏曉露，劉婧，高菁霞，等.二乙烯亞胺滅活流感病毒的效果觀察［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2008，21（5）：395-397.

［5］Habib Mudasser，Hussain Iftikhar，Irshad Hamid，et al.Immunogenicity of formaldehyde and binary ethylenimine inactive infectious bursal disease virus in broiler chicks［J］.Journal of Zhejiang University SCIENCE B ，2006，7（8）：660-664.

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