胡天野，吳同壘，孟慶峰，邊 宇，單曉楓，康元環(huán)，王偉利，錢愛東

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，AV）屬于弧菌科、氣單胞菌屬，做為一種新型的人-獸-魚共患病病原菌，不僅可以使水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病，對(duì)人類自身安全也存在一定的威脅。其在自然界廣泛存在，尤其可能存在水產(chǎn)動(dòng)物的腸道中，在宿主機(jī)體抵抗力下降時(shí)，可能隨時(shí)威脅其健康。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)其研究尚處于起步階段，而且大多為分離鑒定，確定其病原，有關(guān)其生物學(xué)特性，鮮有報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)擬采用框鏡鯉源維氏氣單胞菌，并對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為維氏氣單胞菌的檢驗(yàn)檢疫提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 維氏氣單胞菌CY0806株，分離自患病框鏡鯉，于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用鯽魚、鰱、團(tuán)頭魴、烏鱧，采自吉林某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重均為100g／尾；試驗(yàn)用昆明系小鼠，購(gòu)自吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重15g／只。

1.3 主要試劑 DL-2000 Marker、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；氣單胞菌培養(yǎng)基RS、TCBS培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 細(xì)菌的復(fù)蘇與計(jì)數(shù)

1.4.1 細(xì)菌的復(fù)蘇 無菌操作取-70℃保存的維氏氣單胞菌CY0806株凍干粉，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)18h，為復(fù)蘇菌液；取該菌液劃線于RS培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，并挑取特征菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)菌的計(jì)數(shù) 采用倍比稀釋法進(jìn)行，稀釋菌液涂布于RS培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h。記錄結(jié)果并推算出原菌液濃度。

1.5 病原菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取上述復(fù)蘇菌液，稀釋成一定濃度，并取0.1mL稀釋液接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，并于培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)取0.1 mL培養(yǎng)液按1.4.2方法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，記錄結(jié)果，并繪制維氏氣單胞菌CY0806株的生長(zhǎng)曲線。

1.6 病原菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征觀察 取復(fù)蘇的病原菌分別劃線接種于TCBS培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、RS培養(yǎng)基等7種不用的瓊脂平板上，同時(shí)接種液體營(yíng)養(yǎng)肉湯，30℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并記錄。

1.7 不同pH值、溫度和滲透壓對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 將復(fù)蘇的菌液接種于不同pH值的液體LB培養(yǎng)基中，每個(gè)pH值梯度用3支試管，30℃培養(yǎng)24h，采用倍比稀釋法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。記錄結(jié)果、觀察不同pH值對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

病原菌復(fù)蘇并接種于正常pH值的液體LB培養(yǎng)基中，并選取不同的溫度培養(yǎng)24h，按上述方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察結(jié)果以測(cè)定不同培養(yǎng)溫度對(duì)維氏氣單胞菌CY0806株生長(zhǎng)的影響。

選取液體LB培養(yǎng)基，其pH值正常，以氯化鈉不同的添加量為滲透壓試驗(yàn)量，接種復(fù)蘇的菌液，30℃培養(yǎng)24h，細(xì)菌計(jì)數(shù)并記錄 ，以此測(cè)定不同的滲透壓對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響。

1.8 病原菌對(duì)不同動(dòng)物的致病力 將復(fù)蘇的病原菌稀釋到1.98×108CFU／mL，腹腔接種試驗(yàn)用鯽魚、鰱、團(tuán)頭魴、烏鱧及小鼠，接種劑量0.2mL／尾（只），每種動(dòng)物接種5尾（只）；同時(shí)設(shè)對(duì)照組，接種無菌PBS，接種劑量和尾（只）數(shù)同上。連續(xù)觀察7d，記錄發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)。

1.9 病原菌部分毒力因子的測(cè)定 依據(jù)已發(fā)表維氏氣單胞菌的幾種毒力基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物。引物、相應(yīng)的退火溫度如下。

溶血素：hlyF：5′-ATAGAATTCCTGAGCGAGAAGGTGAC-3′，hlyR：5′-TATAAGCTTTTACCACCACT TCACTTCAC-3′，退火溫度58℃；鞭 毛：flaF：5′-GCGGAATTCATGGGCCTTTATA-TCA-3′，flaR：5′-ACGAAGCTTTTAGCCTTGCCAACAGA-3′，退火溫度58℃；絲氨酸蛋白酶：serF：5′-CACCGAAGTATTGGGTCAGG-3′，serR：5′-GGCTCATGCGTAACTCTGGT-3′，退火溫度57℃；氣溶素：aerF：5′-CCTATGGCCTGAGCGA-GAAG-3′，aerR：5′-CCAGTTCCAGTCCCACCACT-3′，退 火 溫 度63℃；細(xì)胞毒性腸毒素：actF：5′-AGAAGGTGACCACCACCAAGAACA-3′，actR：5′-AACTGACAT-CGGCCTTGAACTC-3′，退火溫度65℃；磷脂酶：lipF：5′-CA（C／T）CTGGT（T／G）CCGCTCAAG-3′，lipR：5′-GT（A／G）CCGAACCAGTCGGAGAA-3′，退火溫度63℃；群體感應(yīng)調(diào)控基因 LusX：F：5′-GATCCTCTCCGAGCGTGG-3′，R：5′-AGGCTTTTCAGCTTCTCTTCC-3′，退火溫度58℃。

反應(yīng)體系（50μL）：PCR Buffer（10×）5μL，dNTP（2.5 mmol／L）4μL，引物（F／R）各1μL，Ex Taq聚合酶1μL，模板（細(xì)菌DNA）1μL，雙蒸水37μL。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 通過倍比稀釋法，在30℃液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)維氏氣單胞菌CY0806株，于0h至51h的不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定菌液濃度，并繪制其生長(zhǎng)曲線如圖1所示。從圖中可以看出，在1～5h時(shí)間段為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5～43h時(shí)間段為穩(wěn)定期，在其中25～27h時(shí)間段有一次再次生長(zhǎng)期，而43h時(shí)間點(diǎn)開始活菌數(shù)緩慢下降，進(jìn)入了細(xì)菌的衰亡期。

圖1 維氏氣單胞菌CY0806株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

2.2 病原菌在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特征觀察 通過30℃在不同鑒別培養(yǎng)基上的恒溫培養(yǎng)24h，分別長(zhǎng)出不同的菌落特征，而在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)也比較旺盛，具體特征如表1所示。

表1 病原菌在不同培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特征

2.3 不同pH值對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 將復(fù)蘇的病原菌接種于不同pH值的液體LB培養(yǎng)基中30℃恒溫培養(yǎng)24h，結(jié)果如下：維氏氣單胞菌CY0806株可以在pH值3～11的范圍內(nèi)存活并生長(zhǎng)，當(dāng)pH值小于3或者大于11時(shí)，該菌不能存活。

2.4 不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌經(jīng)復(fù)蘇后，接種于液體LB培養(yǎng)基中，分別在20℃、23℃、26℃、28℃、30℃、37℃、40℃、42℃恒溫培養(yǎng)24h，得到如下結(jié)果：維氏氣單胞菌CY0806株在28℃、30℃生長(zhǎng)最好，其也可在20℃和40℃生長(zhǎng)，在42℃培養(yǎng)24h有一定的存活。

2.5 不同滲透壓對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌復(fù)蘇后，接種到含不同濃度氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌CY0806株在氯化鈉含量為0%～5%培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在含6%氯化鈉培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。

2.6 病原菌對(duì)不同動(dòng)物的致病力 病原菌經(jīng)腹腔注射感染小鼠和幾種養(yǎng)殖魚類，在7d內(nèi)，感染動(dòng)物均表現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀，其中：小鼠、鰱、團(tuán)頭魴在4d內(nèi)全部死亡；但鯽和烏鱧對(duì)其有一定的抵抗力，只引起發(fā)病、并未死亡，這兩種魚主要臨床癥狀具體表現(xiàn)為鱗片、鰭條有出血點(diǎn)，剖檢可見組織臟器有少量出血點(diǎn)。

2.7 病原菌部分毒力因子的測(cè)定 經(jīng)PCR檢測(cè)，維氏氣單胞菌CY0806株具有多種毒力基因。具體結(jié)果如圖2所示。

圖2 維氏氣單胞菌CY0806株幾種毒力因子基因的PCR檢測(cè)

3 討論

維氏氣單胞菌作為一種新型人-獸-魚共患病病原菌在國(guó)內(nèi)研究剛剛起步，有關(guān)生物學(xué)特性的研究更少見報(bào)道。CY0806株分離自框鏡鯉，研究其生物學(xué)特性對(duì)更好的預(yù)防和治療由該菌引發(fā)的疾病可以起到十分重要的作用。

本試驗(yàn)首先對(duì)其生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定方法采用鑒別培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)的方法，這樣可以防止雜菌污染帶來的試驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差。在生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法上，許多報(bào)道均采用測(cè)其OD值的方法，而筆者認(rèn)為，OD值與活菌數(shù)的線性關(guān)系在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是比較符合的，但到了穩(wěn)定期，活菌數(shù)變化不大，但總菌數(shù)卻在增加，此時(shí)測(cè)定的OD值與活菌數(shù)就不呈線性關(guān)系，而與總菌數(shù)呈一定的線性關(guān)系。因此，筆者采用了計(jì)數(shù)的方法測(cè)定了其生長(zhǎng)曲線。在繪制生長(zhǎng)曲線時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌在液體LB培養(yǎng)基中出現(xiàn)了二次生長(zhǎng)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象并不是維氏氣單胞菌的特有，究其原因可能是細(xì)菌首先利用了自己最為偏好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在該物質(zhì)用盡之后，又再次利用了其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。而具體到是何物質(zhì)，由于LB液體培養(yǎng)基組成的復(fù)雜性，尚難做出判定。

在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特征觀察中可以發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌可以在多種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，這就提示，在分離維氏氣單胞菌時(shí)不一定就局限用RS鑒別培養(yǎng)基；本研究的結(jié)果，與房海等［7］的研究有一定的差別，可能是菌種來源的不同導(dǎo)致。

本試驗(yàn)還針對(duì)維氏氣單胞菌CY0806株在不同培養(yǎng)pH值、培養(yǎng)溫度以及滲透壓的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該菌可以在較為強(qiáng)的酸堿環(huán)境、較為廣泛的溫度、無鹽［1］或鹽度較高的環(huán)境中生長(zhǎng)，作為一種人獸共患病病原菌，該菌的耐受能力較強(qiáng)，預(yù)示這種細(xì)菌可以在較為廣泛的環(huán)境中生存，人類接觸該菌的機(jī)會(huì)可能增大，并患病的可能性增強(qiáng)，該菌的耐受能力的測(cè)定結(jié)果，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

在測(cè)定該菌對(duì)不同動(dòng)物致病力的測(cè)定可以證實(shí)，維氏氣單胞菌CY0806株不僅可以引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物的發(fā)病，還可引發(fā)哺乳動(dòng)物（小鼠）發(fā)病，甚至死亡。而相對(duì)抵抗力較強(qiáng)的鯽和烏鱧，接種病原菌雖然沒有引起死亡，但卻大多數(shù)發(fā)病，最終結(jié)果耐過，這也提示，鯽和烏鱧更可能攜帶維氏氣單胞菌甚至是致病株。而筆者實(shí)驗(yàn)室正在做的維氏氣單胞菌在烏鱧體內(nèi)的調(diào)查初步結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，烏鱧體內(nèi)確實(shí)存在維氏氣單胞菌，提示鮮活水產(chǎn)品可能攜帶維氏氣單胞菌，甚至是致病株，需要我們加大力度檢測(cè)。

經(jīng)PCR檢測(cè)，菌株CY0806具有多種毒力基因，而致病性試驗(yàn)也證實(shí)，該菌株具有較強(qiáng)的致病性，說明，毒力基因攜帶數(shù)量的多少與致病性的強(qiáng)弱確實(shí)存在一定的相關(guān)性。此外，毒力因子的表達(dá)與群體感應(yīng)機(jī)制的調(diào)控密切相關(guān)，本試驗(yàn)從菌株CY0806基因組中擴(kuò)增出了群體感應(yīng)調(diào)控基因LusX，也間接證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

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