吳亞瓊，高志強，吳延功，張鶴曉，喬彩霞，張利峰，單 虎，尹燕博，朱淑芬，王慧珊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266034；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安 271018）

口蹄疫是口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性的偶蹄動物共患傳染病，導(dǎo)致幼畜死亡，成年動物生產(chǎn)性能下降［1］。根據(jù)Christianson等報道，該病流行范圍廣，暴發(fā)后很難控制和消滅，至今仍沒有較好的防治方法，使國際社會畜牧業(yè)貿(mào)易損失慘重［2-3］。

目前國內(nèi)進出口檢疫經(jīng)常采用常規(guī)RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR來檢測口蹄疫病毒，其中5′NCR和2B區(qū)域的核酸序列在7個型間最為保守，為口蹄疫病毒通用性核酸檢測方法的靶區(qū)域，而1D區(qū)域為分型核酸檢測方法的靶區(qū)域［4-5］。本研究參考相關(guān)項目標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方法［6］，針對目前口蹄疫病毒核酸擴增檢測缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的現(xiàn)狀，以口蹄疫病毒亞洲1型核酸為模板，分別對以上具有檢測意義的片段進行RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究，并由多家實驗室運用共同定量的方法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 ROCHE公司的LightCycler 2.0，Roche 480熒光PCR儀，ABI7900HT熒光PCR儀。

1.2 試劑 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6試劑盒，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ，購自Promega公司；DNA快速純化回收試劑盒，質(zhì)?？焖偬崛〖兓噭┖校徸訲aKaRa公司，Trizol，購自Invitrogen公司；其余所有常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 病毒核酸 口蹄疫亞洲Ⅰ型As-1／PK-1／2005病毒核酸，北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.4 熒光定量RT-PCR引物探針 分別根據(jù)5′NCR和1D區(qū)域序列設(shè)計引物探針對標(biāo)準(zhǔn)品進行定量研究。引物探針序列見表1。

1.5 口蹄疫病毒As-1／PK-1／2005的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴增、克隆和序列分析 設(shè)計引物擴增As-1／PK-1／2005的2個基因片段。引物序列見表2。

表1 熒光RT-PCR引物探針序列

表2 擴增口蹄疫病毒As-1／PK-1／20051nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的引物名稱、序列

對擴增產(chǎn)物進行純化后，克隆入TaKaRa公司的pMD20-T載體，挑取出多個克隆依次進行PCR鑒定、酶切鑒定、測序，逐步篩選出正確的克隆。

1.6 SP6體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 對上述重組質(zhì)粒序列進行分析，選用Bam HⅠ進行完全酶切，可以切出含SP6啟動子的先行化DNA片段。用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)物中加入DNase除去其中的DNA模板后，然后用Trizol法重提RNA，將得到的RNA沉淀溶于1.0mL的無RNA酶的滅菌水中，分裝，20μL／管，凍存于-80℃下，即得到制備好的2種RNA片段。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值 取制備的兩種體外轉(zhuǎn)錄RNA，用DEPC水分別作200倍稀釋，測定其260 nm和280nm的吸光度值（A260和A280），并通過計算其比值來衡量物質(zhì)的純度。根據(jù)測序結(jié)果，利用DNAMAN（Version 6）得出單鏈模板的分子量（MW）。按照下面公式計算初步拷貝數(shù)［7］：拷貝數(shù)＝A260×40×200×微升數(shù)×10-9×6.02×1023次／MW

根據(jù)計算結(jié)果，對兩個片段分別應(yīng)用稀釋液（Trizol∶水＝3∶1）稀釋至1×109copies／μL。將制備的兩種RNA進行等體積混合，然后進行分裝，100μL／管。

1.8 均勻性檢驗 隨機抽取10管標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用表1引物探針在重復(fù)條件下在2次試驗中分別測試這10份RNA樣品，手動設(shè)置基線，獲取Ct值。結(jié)果數(shù)據(jù)用單因子方差分析進行統(tǒng)計處理。

1.9 穩(wěn)定性檢驗 選擇1nt～2208nt片段作為目標(biāo)進行穩(wěn)定性檢驗。隨機抽取制備的標(biāo)準(zhǔn)品，在以下每種條件下放置10支：（1）室溫20℃～25℃，相對濕度20%～50%，14d取出進行測試。（2）冰箱冷藏溫度2℃～8℃，6個月取出進行測試。（3）-20℃，1年后取出進行測試。（4）對照，-80℃，長期放置。

對制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）計算其拷貝數(shù)，進一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。隨機抽取按上述條件處理后的標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用建立的口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型熒光RT-PCR方法來間接測定重新提取的RNA的拷貝數(shù)。采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗-t檢驗進行統(tǒng)計分析。

1.10 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定 采用委托8家外部實驗室協(xié)作標(biāo)定的方法來對制備的標(biāo)準(zhǔn)品進行定值。分別對制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）計算其拷貝數(shù)，進一步系列稀釋制成一系列外標(biāo)品。應(yīng)用建立的口蹄疫病毒通用熒光RT-PCR方法（針對5′NCR和2B）來間接測定標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.11 不確定度分析 通過對實際檢測過程進行分析，確定標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度，進行評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴增、克隆和序列分析 采用表2的引物，成功擴增了口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段，并克隆入pMD20-T載體，見圖1。分析序列選取XbaⅠ、Ecor lⅠ對1nt～2208nt片段和PstⅠ對3012nt～5155nt片段酶切鑒定正確，見圖2。

對正確的克隆進行測序，選取序列正確的克隆命名為 pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）。

2.2 SP6體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA 用Bam HⅠ酶切上述質(zhì)粒，均能切出含SP6啟動子和目的DNA的片段。線性化后進行體外轉(zhuǎn)錄獲得大量的2種RNA片段，純化溶于1.0mL的無RNA酶的滅菌水中，分裝為20μL／管，共50管，凍存于-80℃中。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備與初步定值 制備的2種RNA進行200倍稀釋后，其A260和A280的比值均在1.9±0.1范圍內(nèi)，表明RNA純度較高。初步計算，1nt～2208nt片段拷貝數(shù)為3.081×1011copies／μL；3012nt～5155nt片段拷貝數(shù)為1.274×1011copies／μL。分別稀釋至1×109拷貝數(shù)／μL進行等體積混合分裝，100μL／管，共800管，凍存于-80℃中。

2.4 均勻性檢驗結(jié)果 對隨機抽取10管標(biāo)準(zhǔn)品測試后數(shù)據(jù)分析見圖3，圖4和表3。

按F臨界值F0.05（9、10）＝3.14。計算的F值分別為2.99和1.45，該值＜F臨界值，這表明在0.05顯著性水平時，樣品中目的核酸片段含量是均勻的。樣品間變異系數(shù)CV%＝，分別為2.17%和2.03%，均小于5%。

2.5 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果 選擇1nt～2208nt片段作為目標(biāo)進行穩(wěn)定性檢驗。將檢測組與對照組（-80℃）數(shù)據(jù)分別作兩樣本均數(shù)顯著性檢驗-t檢驗進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表4，表明檢測組與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品均勻性試驗方差分析結(jié)果

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 采用委托8家外部實驗室協(xié)作標(biāo)定的方法來對制備的標(biāo)準(zhǔn)品進行定值。經(jīng)統(tǒng)計分析，取平均值作為定值結(jié)果，結(jié)果見表5。

2.7 不確定度分析 標(biāo)準(zhǔn)品的總不確定度包括：分析測定誤差、RNA提取過程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。根據(jù)我國對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理法規(guī)［8］定值結(jié)果表示方法，可以通過A類評定方法［9］進行評定。協(xié)作標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)差涵蓋了以上不確定度分量。因此可作為本批標(biāo)準(zhǔn)品2個基因片段的不確定度（見表5）。

3 結(jié)語與討論

目前市場上有許多口蹄疫病毒核酸檢測試劑，但缺乏評價和驗證。根據(jù)文獻，5′NCR、2B和1D區(qū)域為目前常用口蹄疫病毒核酸檢測方法的檢測區(qū)域。因此，選用可以完全包含以上區(qū)域的1nt～2208nt和3012nt～5155nt2個片段來制備RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。RNA極易降解，我們選擇商品化的RNA提取裂解液Trizol作為基質(zhì)分散RNA，結(jié)果表明其均勻性及穩(wěn)定性效果均很好。

多項結(jié)果分析表明，本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以在實際生產(chǎn)中作為參比品應(yīng)用于目前檢測方法的評價和驗證，對逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增2個方面進行質(zhì)量控制，同時用來規(guī)范用于檢測的試劑和實驗室的質(zhì)量，消除不同人員操作間的差異，為量值傳遞提供參比品，具有實用性和適用性。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品t檢驗統(tǒng)計結(jié)果

表5 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

人醫(yī)的某些疾病中已應(yīng)用我國自己的核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使我國定量檢測缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果沒有可比性的現(xiàn)狀有了很大改進。而動物疾病標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究還趨于空白，造成檢測結(jié)果存在10～100倍的差異。因此，制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化已經(jīng)是目前檢測動物疾病規(guī)范化的一個重要趨勢。

［1］朱文釧，孔繁德，林祥梅.口蹄疫檢測技術(shù)的研究進展與應(yīng)用［J］.經(jīng)濟動物學(xué)報，2009，13（3）：171-172.

［2］Francisco S，Margarita S，Miguel A，et al.Foot-and-mouth disease virus：a long known virus，but a cunent threat［J］.Vet Res，2001，32（1）：30.

［3］Stone R.Foot-and-mouth disease.Report urges U.K.to vaccinate herds［J］.Science，2002，297（5580）：319-321.

［4］Scott M R，Geoffiey H H，Nigel P F，et al.Dia-gnosis of foot-and-mouth disease by RT-PCR rev-aluation of primers for stereotypic characterisation of viral RNA in clinical samples［J］.J Virol Med，1999，83：113-123.

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