焦豪妍，楊燕軍，徐吉銀，張華秀（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥研究所，廣州51050；.廣東中山市中智藥業(yè)集團有限公司，廣東中山 58437）

玄參（Scrophulariae Radix）為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根，主要分布于安徽、江蘇、浙江、福建、江西、湖南、湖北和貴州等地。臨床上用于治療熱病傷陰、舌絳煩渴、溫毒發(fā)斑、津傷便秘、骨蒸勞嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉和癰腫瘡毒證[1]。玄參中已分離出化學(xué)成分50多種，主要含有環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、有機酸及揮發(fā)油等[2]。

中藥破壁粉粒是在中醫(yī)“治未病”的治療思想和辨證論治的理論體系指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代先進的超微粉碎技術(shù)開發(fā)出的一種新型中藥飲片。它是將特定的單味中藥飲片進行細胞級粉碎，在粉碎過程中，中藥不同組織、不同部位經(jīng)過粉碎和混煉后，各種物質(zhì)組分充分暴露和勻化，形成均勻包含各種相同比例物質(zhì)組分的破壁粉體，再采用成型技術(shù)將中藥破壁粉體加工成40～80目的顆粒。它具有安全性高、均勻度高、生物利用度高、藥材利用率高、應(yīng)用方式便捷靈活等優(yōu)點。

色譜指紋圖譜分析技術(shù)作為鑒別中藥材及其制劑整體質(zhì)量的有效手段得到越來越廣泛的應(yīng)用[3，4]。文獻報道玄參的指紋圖譜研究多采用高效液相色譜（HPLC）法[5，6]。因此，本試驗采用HPLC法首次建立了玄參飲片-破壁粉體-破壁粉粒三者的指紋圖譜并進行比較，旨在從整體和宏觀上控制玄參破壁粉粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

2695 HPLC儀、2996DAD檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；HS10260D超聲波清洗器（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司，頻率：40 kHz，功率：500 W）。

哈巴俄苷、肉桂酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111730-200604、110786-200503）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純；玄參藥材購自浙江省盤安縣大盤鎮(zhèn)，采摘期為農(nóng)歷10月、11月，經(jīng)廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院劉曉春副教授鑒定為玄參科植物玄參的干燥根；玄參破壁粉體和破壁粉粒樣品由中山市中智藥業(yè)集團有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL Sciences Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-1%冰醋酸水（B），梯度洗脫（0～45 min，10%～70%A；45～55 min，70%～90%A；55～65 min，90%～90%A）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 玄參飲片、破壁粉體及破壁粉粒供試品溶液的制備

取玄參飲片、破壁粉體和破壁粉粒樣品各10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇35 mL，密塞，稱定重量，浸泡18 h，超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 （1）取哈巴俄苷對照品適量，精密稱定，用30%甲醇溶解制成濃度為550 μg·mL-1的溶液，即得哈巴俄苷對照品溶液。（2）取肉桂酸對照品適量，精密稱定，用30%甲醇溶解制成濃度為710 μg·mL-1的溶液，即得肉桂酸對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白試驗 吸取空白溶劑（95%乙醇）10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白無干擾。

2.3.2 精密度試驗 取同一批供試品（玄參飲片1號）溶液適量，連續(xù)進樣5次，記錄指紋圖譜。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件計算，在同一臺儀器測得的色譜指紋圖譜的相似度均＞0.950，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積的RSD均＜5.00%，表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品（玄參飲片1號）溶液適量，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h檢測指紋圖譜。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件計算，在同一臺儀器測得的色譜指紋圖譜的相似度均＞0.950，各主要色譜峰相對保留時間的RSD均＜5.00%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批次樣品（玄參飲片1號）適量，按“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，記錄指紋圖譜。用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件計算，在同一臺儀器測得的色譜指紋圖譜的相似度均＞0.950，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積的RSD均＜5.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及各項技術(shù)參數(shù)的測定

2.4.1 標(biāo)準指紋圖譜和共有指紋峰標(biāo)定 按“2.1”項下色譜條件測定10批玄參飲片、10批破壁粉體和10批破壁粉粒的指紋圖譜，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件對指紋圖譜數(shù)據(jù)進行評價，詳見圖1～圖3；制定優(yōu)化的10批玄參飲片、10批破壁粉體和10批破壁粉粒的標(biāo)準指紋圖譜（共有模式），詳見圖4～圖6?？纱_定玄參飲片、破壁粉體和破壁粉粒的共有峰均為14個，經(jīng)對照品鑒定其中玄參飲片10號峰、破壁粉體與破壁粉粒11號峰為肉桂酸，玄參飲片12號峰、破壁粉體與破壁粉粒13號峰為哈巴俄苷，玄參飲片和破壁粉粒中肉桂酸的色譜峰響應(yīng)更高，因此確定肉桂酸的峰為參照峰。

圖1 10批玄參飲片的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 10 batches of S.ningpoensis decoction pieces

圖2 10批玄參破壁粉體的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprints of 10 batches of S.ningpoensis cellwall broken powder

2.4.2 共有峰的相對保留時間和相對峰面積 玄參飲片以10號峰的保留時間和峰面積為1，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各批次玄參飲片中共有峰的相對保留時間非常接近，RSD在0.00%～1.30%之間，這也進一步證實了共有峰選擇的準確性。而各批樣品之間共有指紋峰的相對峰面積存在一定的差異，證明不同批次的藥材樣品在含量上存在一定的差異。

玄參破壁粉體和破壁粉粒以11號峰的保留時間和峰面積為1，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各批次破壁粉體和破壁粉粒中共有峰的相對保留時間非常接近，RSD分別在0.00%～0.51%和0.00%～0.82%之間，同樣也進一步證實了共有峰選擇的準確性；各批樣品之間共有

指紋峰的相對峰面積存在一定的差異，同樣證明不同批次的破壁粉體和破壁粉粒樣品在含量上存在一定的差異。

2.4.3 相似度計算 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”軟件分別對10批玄參飲片、10批破壁粉體和10批破壁粉粒的指紋圖譜進行相似度分析，分別與各自的標(biāo)準指紋圖譜（共有模式）比較，可得10批玄參飲片的相似度為0.969、0.948、0.943、0.991、0.999、0.991、0.980、0.992、0.993 和0.997；10批破壁粉體的相似度為0.986、0.906、0.976、0.993、0.992、0.996、0.991、0.984、0.992和0.996；10批破壁粉粒的相似度為0.986、0.938、0.978、0.995、0.995、0.999、0.979、0.989、0.989和0.995。玄參飲片、破壁粉體和破壁粉粒的相似度均＞0.900，表明所建立的指紋圖譜技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定、重復(fù)性較好。

2.4.4 玄參飲片-破壁粉體-破壁粉粒相關(guān)性的研究 破壁粉粒作為一種新型的飲片，破壁粉體相當(dāng)于中間產(chǎn)品。筆者對飲片-破壁粉體-破壁粉粒三者的相關(guān)性進行了研究，比較圖4～圖6可以看出，三者生成的共有模式非常相似，標(biāo)注的共有峰也基本相似，從飲片到破壁粉體再到破壁粉粒各主要成分相關(guān)性良好、歸屬性強，能全面評價破壁粉粒的質(zhì)量。

圖3 10批玄參破壁粉粒的HPLC指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprints of 10 batches of S.ningpoensis cellwall broken particle

圖4 玄參飲片的HPLC標(biāo)準指紋圖譜（參照物為10-肉桂酸）Fig 4 Standard HPLC fingerprint of S.ningpoensis decoction pieces（reference substance 10-cinnamic acid）

圖5 玄參破壁粉體的HPLC標(biāo)準指紋圖譜（參照物為11-肉桂酸）Fig 5 Standard HPLC fingerprint of S.ningpoensis cellwall broken powder（reference substance 11-cinnamic acid）

圖6 玄參破壁粉粒的HPLC標(biāo)準指紋圖譜（參照物為11-肉桂酸）Fig 6 Standard HPLC fingerprint of S.ningpoensis cellwall broken particle（reference substance 11-cinnamic acid）

3 討論

本試驗比較了甲醇-水和甲醇-1%冰醋酸水作為流動相時玄參藥材的圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-1%冰醋酸水作流動相系統(tǒng)干擾小、峰形好、成分峰數(shù)目多、分離度大，故而選用甲醇-1%冰醋酸水作為流動相。

根據(jù)玄參中所含主要成分的性質(zhì)，試驗比較了甲醇和95%乙醇作為提取溶劑時樣品的圖譜，發(fā)現(xiàn)采用95%乙醇提取時樣品出峰數(shù)目較多、含量較高，故選其作為提取溶劑。

玄參飲片分別浸泡5、17、20 h，超聲1 h，置冷，補重，搖勻，過濾，經(jīng)進樣分析，提取17 h與20 h的效率較高，且兩者差異不大，因此確定玄參藥材的提取時間為18 h。

本試驗采用HPLC法對玄參飲片-破壁粉體-破壁粉粒的指紋圖譜進行了研究，分別標(biāo)示了14個共有色譜峰，方法簡便、穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，對玄參破壁粉粒的質(zhì)量評價具有參考價值。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：108.

[2]黃 雄，黃 嬛.中藥玄參的研究進展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2007，13（10）：103.

[3]王 穎.復(fù)方丹參片的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2010，21（23）：2 126.

[4]姬生國，郭念欣，李穎春，等.廣金錢草及其制劑的HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2010，21（27）：2 543.

[5]白志川.玄參藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中藥材，2006，29（12）：1 295.

[6]余 靜，張尊建，楊春華.玄參HPLC/UV指紋圖譜研究[J].藥學(xué)進展，2005，29（10）：465.