曹明晶 周 平 李法琦 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)是細胞膜及細胞外基質中的一種蛋白聚糖，具有多種重要的生物學功能，如維持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，維持血管通透性，抑制細胞黏附〔1～3〕，調節(jié)細胞的增殖等。多配體蛋白聚糖(SDC－1)屬于黏附分子整合素跨膜黏結蛋白聚糖家族成員，在炎癥過程中通過其胞外段硫酸乙酰肝素鏈(屬于GAGs)共價結合多種胞外配體，結合各種生物分子及調節(jié)各種結合蛋白的生物學功能，參與炎癥反應的多個環(huán)節(jié)〔4〕。但有關HSPG和SDC－1在心肌缺血再灌注的表達水平及阿托伐他汀對兩者的影響鮮見報道。本實驗以大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)為模型，分析阿托伐他汀對大鼠MIRI后HSPG和SDC－1的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠，體質量(250±30)g，合格證號:SCXK(渝)2007－0001，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 阿托伐他汀(大連輝瑞制藥有限公司)，HSPG、syndecan－1單克隆抗體(Santa Cruz)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，RT－PCR 試劑盒(TaKaRa)，HSPG、SDC－1 ELISA 試劑盒(R＆D)。

1.3 實驗分組與給藥 健康SD大鼠40只，隨機分為4組，每組10只，建造MIRI模型。假手術組:只穿線不結扎冠狀動脈;IR組:穿線結扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min;阿托伐他汀組:穿線結扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min，手術前3 d給予阿托伐他汀(20 mg·kg－1·d－1)灌胃;生理鹽水組:穿線結扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min，手術前3 d給予生理鹽水1 ml灌胃。實驗結束后各組隨機抽取4只制作病理切片，其余各組6只觀察其他指標。

1.4 實驗方法與觀察指標

1.4.1 實驗動物MIRI模型的制作 大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，氣管插管，接動物人工呼吸機(80次/min，潮氣量20 ml/kg，呼吸比1∶1)，鏈接多功能生理記錄儀記錄心電圖。在胸骨左緣3、4肋間開胸，打開心包膜，暴露心臟。于冠狀動脈左前降支起始0.2 cm處與肺動脈圓錐旁之間墊一2 mm聚乙烯小管加壓，用6－0縫線結扎左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min。結扎成功即心電圖導聯(lián)ST段抬高，局部心肌明顯變蒼白，再灌注成功即蒼白心肌恢復紅潤或出現(xiàn)再灌注心律失常。

1.4.2 心肌形態(tài)學結構的觀察 實驗結束立即取下心臟，用生理鹽水洗凈心腔內積血后迅速放入4%多聚甲醛中固定。從心尖以間距0.3 cm橫向連續(xù)切片至冠脈穿線處，石蠟包埋切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察心肌形態(tài)變化。

1.4.3 免疫組化檢測冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1表達每只大鼠石蠟切片5張，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復，抗HSPG(1∶100)、SDC－1(1∶50)抗體孵育，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.4 RT－PCR檢測HSPG、SDC－1 mRNA表達 每組大鼠隨機取6只快速留取冠狀動脈左前降支，加液氮研磨，按試劑盒說明用Trizol提取的步驟進行總RNA提取，得到的總RNA測定OD值，取OD值在1.8～2.0之間的總RNA進行逆轉錄，逆轉錄步驟按試劑盒說明進行。每一標本取 cDNA 1 μl進行PCR反應，PCR反應體系為25 μl。所用引物由上海Invitrogen生物技術公司合成:HSPG正義鏈:5′－GAT CTGACAACATCCCAACTGA－3′，反義鏈:3′－AACAACAGGATGAGGAAAATGG－5′(302 bp);SDC－1 正義鏈:5′－CAGCAGCAACACCGAGAC－3′，反義鏈:3′－CTCCTACCTTGACGGTTAG－5′(359 bp);GAPDH 正義鏈:5′－AGGCCGGTGCTGAGTATGTC －3′，反 義 鏈:3′－T GCCTGCTTC ACCACCTTCT－5′(530 bp)。PCR 反應條件:94℃預變性3 min，94℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃ 延伸 45 s，共 35 個循環(huán)，72℃最后延伸5 min。取PCR產(chǎn)物3 μl，2%瓊脂糖上電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進行條帶光密度半定量分析，計算HSPG、SDC－1 mRNA 相對值。

1.4.5 ELISA檢測血清中HSPG、SDC－1含量 實驗結束后經(jīng)頸靜脈取血，2000 r/min，離心5 min，取上層血清－20℃保存。根據(jù)試劑盒說明，ELISA法測定血清HSPG、SDC－1含量。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 心肌組織形態(tài)學的變化 光鏡下假手術組心肌纖維排列整齊，染色均勻，橫紋清晰，心肌間質無炎性細胞浸潤，無出血壞死;IR組心肌纖維腫脹，排列紊亂，有灶性出血，心肌間質大量炎性細胞浸潤;阿托伐他汀組心肌纖維輕度腫脹，心肌間質無出血，有少量不等的炎性細胞浸潤;生理鹽水組心肌組織形態(tài)與IR組相似。見圖1。

2.2 免疫組化檢測冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1表達 在假手術組冠狀動脈左前降支內膜內皮細胞的基底膜處有較多HSPG和SDC－1陽性物質的表達，但IR組HSPG和SDC－1的表達明顯減少或缺如，說明MIRI可導致內皮細胞糖萼受損。與IR組和生理鹽水組相比，阿托伐他汀組HSPG和SDC－1表達增多，提示阿托伐他汀可抑制內皮細胞糖萼脫落。見圖2。

圖1 心肌組織HE染色(×100)

2.3 RT－PCR測定冠狀動脈左前降支 HSPG、SDC－1 mRNA表達 灰度掃描結果顯示，與假手術比，IR組大鼠冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1含量減少(P＜0.05)，但與生理鹽水組無明顯差異(P＞0.05);與IR組和生理鹽水組比，阿托伐他汀組大鼠冠狀動脈左前降支HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)。見圖3、表 1。

2.3 ELISA檢測血清中HSPG、SDC－1含量變化 結果顯示，與假手術比，IR組大鼠血清中HSPG、SDC－1含量增加(P＜0.05)，但與生理鹽水組無明顯差異(P＞0.05);與IR組和生理鹽水組比，阿托伐他汀組大鼠血清中 HSPG、SDC－1含量減少(P＜0.05)。見表1。

表1 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表達及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

表1 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA的表達及血清HSPG、SDC-1水平( ± s，n=6)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與IR組比較:2)P＜0.05

組別 mRNA 血清1.07±0.04 0.98±0.05 233.83±0.99 34.17±0.73 IR組 0.37±0.021) 0.42±0.031) 827.53±0.981)119.44±0.941)阿托伐他汀組 0.71±0.401) 0.76±0.021)560.53±0.581)2)61.65±0.741)2)生理鹽水組 0.40±0.011)2)0.43±0.031)2)827.35±0.721)118.94±0.561)HSPG SDC－1假手術組HSPG SDC－1

圖2 各組冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1表達(×100)

圖3 冠狀動脈左前降支HSPG、SDC-1 mRNA表達

3 討論

HSPG是細胞膜及細胞外基質中的一種蛋白聚糖，具有多種重要的生物學功能，如維持血管壁的抗凝表面、防止血栓形成，維持血管通透性，抑制細胞黏附〔1～3〕，參與某些生長因子與其受體的結合，調節(jié)細胞的增殖等。由于其多樣化的結構功能和在細胞識別、細胞黏附中的作用日益受到重視，成為當今研究的熱點之一。SDC－1屬于黏附分子整合素跨膜粘連蛋白聚糖家族成員，通過其分子表面的硫酸肝素側鏈可結合一系列配基，如細胞黏附分子、基質成分、生長因子、酶和酶抑制物等，以共受體方式調節(jié)細胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與新生血管形成、傷口愈合以及白細胞與內皮細胞間的相互作用〔5〕。近年來，其在血管內皮細胞中的作用逐漸得到國內外學者重視。

HMG－CoA還原酶抑制劑，能通過抑制HMG－CoA還原酶而抑制膽固醇的合成，是目前臨床上治療高膽固醇血癥最有效的一類藥物。但他汀類藥物除治療高脂血癥外，還具有以下重要作用〔6～8〕:①抗炎作用:大量的動物實驗已表明這類藥物能減少腫瘤壞死因子α、白細胞介素－1和白細胞介素－6。②改善血管內皮細胞功能:他汀類藥物通過激活磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶Akt通路，增加血管內皮細胞NO合酶活性和NO的生成，從而改善內皮細胞功能。本實驗結果說明在心肌缺血再灌注損傷中，阿托伐他汀可明顯減少炎性細胞的浸潤，減少心肌纖維斷裂壞死，維持細胞正常形態(tài)結構，可見阿托伐他汀具有明顯心臟保護作用。

研究表明，心肌缺血在灌注本身是一種過度的炎癥反應結果，在缺血壞死心肌灶上可見有明顯的炎癥細胞浸潤，而趨化因子及白細胞是心肌局部缺血的聯(lián)集反應的起始原因之一〔9～11〕。即使缺血的心肌復流減少了心肌壞死，但再灌注的血液成分中含趨化因子募集來的炎癥介質可損傷心肌，從而引起再灌注損傷。HSPG和SDC－1可通過抑制凝血及細胞黏附等生物功能發(fā)揮一系列血管保護作用。本實驗說明缺血再灌注損傷可使內皮細胞上HSPG、SDC－1發(fā)生脫落，從而減弱其對血管的保護作用，本實驗阿托伐他汀可以抑制內皮細胞上HSPG、SDC－1脫落而發(fā)揮其心血管保護作用。但生物體是復雜的整體，其生物學反應是復雜且相互關聯(lián)的，外源因素與基因表達的作用也是非常復雜的，所以阿托伐他汀抑制內皮細胞HSPGS、DC－1脫落的機制有待進一步研究。

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