賈 川 宋志勇 胡進(jìn)中 申軍華 程 念 李芳芳

(河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生發(fā)展受遺傳因素和環(huán)境因素等多種因素影響。流行病學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)的各項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了有三個(gè)基因(APP、PSEN1、PSEN2)的致病性突變是引起早發(fā)性AD的原因。有一個(gè)基因(APOE)與遲發(fā)性AD有關(guān)。目前，在AD的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)約350個(gè)基因與AD有相關(guān)性，它們分散存在于23對(duì)染色體。在這之中包括雌激素受體α基因(ER－α)和低密度脂蛋白受體基因(LDLR)〔1〕。利用PET技術(shù)檢測(cè)大腦不同區(qū)域的葡萄糖代謝，發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥的老年人群腦的某些區(qū)域葡萄糖的利用率降低，更為重要的是葡萄糖利用率降低的區(qū)域特征與AD患者類似，而與正常衰老個(gè)體不同〔2～4〕。本研究觀察正常中老年人群 APOE、LDLR、ER－α 多態(tài)性與血清膽固醇水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 河北省石家莊市社區(qū)內(nèi)居住的45歲以上普通健康中老年人群，隨機(jī)抽樣201名志愿者。均在石家莊居住20年以上，男52名，女149名，年齡45～85歲。

1.2 主要儀器與材料 PCR PX2 Thermal Cycler美國(guó)Thermo公司，捷達(dá)801系列凝膠成像分析系統(tǒng)江蘇捷達(dá)，Taq DNA聚合酶Promega生物技術(shù)有限公司，10 mmol/L dNTP，PCR擴(kuò)增上下游引物，限制性內(nèi)切酶HhaⅠ，限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ，限制性內(nèi)切酶AvaⅡ，甘油三酯、總膽固醇和血糖試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 一般情況 排除自述患有糖尿病病史及正在服用降脂類藥物的志愿者。

1.3.2 采用葡聚糖沉淀法從全血白細(xì)胞中提取模板DNA

向抗凝處理外周靜脈血3 ml中加入1.5 ml葡聚糖溶液(4%)，靜置45～60 min后，吸取淡黃色上清液，離心2 000 r/min 10 min。棄上清，向沉淀的細(xì)胞加入1 ml三蒸水，吹打開細(xì)胞團(tuán)后離心2 000 r/min 10 min。棄上清，向沉淀細(xì)胞加入1 ml生理鹽水，吹打開細(xì)胞團(tuán)后離心2 000 r/min 10 min。棄上清，向沉淀的細(xì)胞加入0.5 ml TES溶液(15 mmol/L)懸浮細(xì)胞，加入100 μl蛋白酶 K(2 g/L)和 160 μl SDS 溶液(10%)，置于 37℃水浴箱中消化過夜。向消化過夜的裂解液中加入等體積的Tris－飽和酚，顛倒混勻10 min，離心 4 000 r/min 10 min。上層水相轉(zhuǎn)入新管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，顛倒混勻10 min，離心4 000 r/min 10 min。上層水相轉(zhuǎn)入新管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻10 min，離心4 000 r/min 10 min。待離心結(jié)束后，上層水相轉(zhuǎn)入新管中，加入1/10體積的NaAc(3 mol/L)和2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕混勻后可見白色絮狀DNA沉淀析出。離心12 000 r/min 15 min。棄上清，用乙醇(75%)漂洗 DNA，離心12 000 r/min 3 min，棄上清，置于室溫晾干，加入 100 μl TE緩沖液溶解DNA，置4℃保存，待用。

1.3.3 DNA濃度及純度鑒定 取適量DNA，稀釋100倍，測(cè)定OD260nm與OD280nm的數(shù)值。計(jì)算DNA濃度和純度(OD260nm/OD280nm的比值在1.6～1.8之間可以用于PCR擴(kuò)增)。

1.3.4 PCR引物 APOE引物:上游引物:5′ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC 3′，下游引物:5′TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A 3′;ER－α 引物:上游引物:5′CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TTC 3′，下游引物:5′TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA 3′;LDLR引物:上游引物:5′GTC ATC TTC CTT GCT GCC TGT TTA 3′，下游引物:5′GGT TCC ACA AGG AGG TTT CAA GGT T 3′。由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.5 PCR－RFLP分析基因多態(tài)性

1.3.5.1 APOE基因多態(tài)性 PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系為:模板 DNA(200 ng 左右)4μl，10 × PCR 緩沖液 3 μl，MgCl2溶液2.5 μl，上游引物(20 pmol/μl)2 μl，下游引物(20 pmol/μl)2 μl，10 mmol/L dNTP(200 μmol/L)0.5 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl，三蒸水 10.5 μl，總體積 25 μl。PCR 循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，69.2℃退火1 min，72℃延伸50 s，變性、退火、延伸共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度應(yīng)為246 bp。HhaⅠ酶切:反應(yīng)體系為:擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，限制性內(nèi)切酶 HhaⅠ(5 U/μl)1 μl，10 × 酶切緩沖液 2 μl，三蒸水補(bǔ)至總體積20 μl。37℃水浴消化過夜。4%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切后產(chǎn)物，凝膠分析成像系統(tǒng)下記錄各樣本酶切后產(chǎn)物的條帶和APOE基因分型。

1.3.5.2 LDLR基因多態(tài)性 PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系為:模板 DNA(200 ng左右)5 μl，10 × PCR 緩沖液 3 μl，MgCl2溶液2.5 μl，上游引物(20 pmol/μl)2 μl，下游引物(20 pmol/μl)2 μl，10 mmol/L dNTP(200 μmol/L)0.5 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.5 μl，三蒸水 9.5 μl，總體積 25 μl。PCR 循環(huán)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 變性 30 s，68℃ 退火 1 min，72℃ 延伸2 min，變性、退火、延伸共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度應(yīng)為228 bp。AvaⅡ酶切:反應(yīng)體系如下:擴(kuò)增產(chǎn)物 7.5 μl，限制性內(nèi)切酶 AvaⅡ(10 U/μl)0.75 μl，10 × 酶切緩沖液2 μl，三蒸水補(bǔ)至總體系20 μl。37℃水浴消化過夜。3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，凝膠分析成像系統(tǒng)記錄各樣本酶切后基因分型。

1.3.5.3 ER－α基因多態(tài)性 PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系:模板DNA(200 ng 左右)5 μl，10 × PCR 緩沖液 2.5 μl，MgCl2溶液2 μl，上游引物(20 pmol/μl)2 μl，下游引物(20 pmol/μl)2 μl，10 mmol/L dNTP(400 μmol/L)1 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)1 μl，三蒸水補(bǔ)至總體積 25 μl。PCR 循環(huán)條件:95℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性 40 s，60℃退火 40 秒，72℃ 延伸 90 s，變性、退火、延伸共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 300 bp。XbaⅠ和PvuⅡ分別酶切ER－α PCR擴(kuò)增產(chǎn)物:XbaⅠ酶切:反應(yīng)體系如下:擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μl，酶 XbaⅠ(15 U/μl)0.75 μl，10%BSA 2 μl，10 × 酶切緩沖液 2 μl，三蒸水 10.25 μl，總體積20 μl。充分混勻后置于37℃水浴箱水浴消化過夜;PvuⅡ酶切:反應(yīng)體系如下:擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μl，PvuⅡ(10 U/μl)0.75 μl，10 × 酶切緩沖液 2 μl，三蒸水補(bǔ)至總體系 20 μl。37℃水浴消化過夜。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，凝膠分析成像系統(tǒng)下觀察各樣本酶切后產(chǎn)物的條帶情況，記錄各樣本ER－α基因分型。

1.3.6 血生化指標(biāo)的測(cè)定 晨起空腹抽取外周靜脈血液1 ml，分離血清。血糖的測(cè)定:葡萄糖氧化酶法。血中總膽固醇測(cè)定:酶比色法。血中甘油三酯測(cè)定:酶比色法。用全自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定高密度脂蛋白膽固醇(HDL－Ch)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL－Ch)，極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL－Ch)含量(河北省中醫(yī)院檢驗(yàn)中心)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用Hardy－Weinbreg平衡檢驗(yàn)方法對(duì)樣本進(jìn)行各個(gè)基因型分布平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)樣本是否具有群體性，代表性。使用SPSS17.0軟件和SAS V8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用直接計(jì)數(shù)法記錄并計(jì)算各基因的基因型，等位基因的頻數(shù)和頻率。組間比較基因頻率，等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。用非參數(shù)Mann－Whitney檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析兩個(gè)組間是否存在差別。用非參數(shù)Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析兩個(gè)以上組間是否存在差別，有差別用Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 APOE基因 APOE基因(HhaⅠ)基因型分為 E2/E2，E2/E3，E2/E4，E3/E3，E3/E4，E4/E4 共 6 型。本次采樣 E2/E2，E4/E4型缺失?？偣矞y(cè)定180人APOE基因型，其中女性132名，男性48人。E2/E3型13.9%，E2/E4型1.1%，E3/E3型76.1%，E3/E4型8.9%。經(jīng)檢驗(yàn)基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡。等位基因頻率 E2共為7.5%，E3共為87.5%，E4共為5%。

APOE基因型組間比較血清總膽固醇水平時(shí)，其中男性、年齡≥60歲亞組中APOE基因型組間膽固醇水平存在差別，Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較:E3/E3型膽固醇水平高于E2/E3型(P=0.041)。若APOE等位基因組間比較膽固醇水平時(shí)，其中男性、年齡≥60歲亞組中膽固醇水平有差別(P=0.025)，Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較:E3等位基因組膽固醇水平高于E2組(P=0.018)，結(jié)果見表1，表2。

表1 APOE基因型之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

表2 APOE等位基因之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

APOE基因型組間比較VLDL－Ch水平時(shí)，其中全性別、全年齡亞組中VLDL－Ch水平可能有差別(P=0.042)，Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較:E2/E3型VLDL－Ch水平高于E3/E3型(P=0.044)。若APOE等位基因組間比較VLDL－Ch水平時(shí)，全性別、全年齡亞組中VLDL－Ch含量可能有差別(P=0.027)，Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較:E2等位基因組VLDL－Ch水平高于E3組(P=0.029)，見表3，表4。

2.2 LDLR基因 LDLR基因(AvaⅡ)基因型分為(AA，aa，Aa)3型?？偣矞y(cè)定182人LDLR基因的基因型，其中女性134名，男性48人。AA型59.4%，aa型1.6%，Aa型39%，經(jīng)檢測(cè)基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡。LDLR等位基因分A，a，等位基因頻率:A等位基因共為78.8%，a等位基因共為21.2%。

LDLR基因基因型組間比較LDL－Ch水平時(shí)，其中全性別、年齡≥60歲亞組中LDLR基因基因型組間LDL－Ch水平存在差異(P=0.03)，Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較:aa型LDL－Ch水平高于Aa型(P=0.034)，見表5。

表3 APOE基因型之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

表4 APOE等位基因之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

表5 LDLR基因等位基因之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

2.3 ER－α(XbaⅠ)基因型 ER－α 基因(XbaⅠ)基因型分為(XX，xx，Xx)3型。總共測(cè)定177人，其中女性132名，男性45人。XX型3.4%，xx型51.4%，Xx型45.2%，經(jīng)檢測(cè)基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡。等位基因分X，x種。等位基因頻率:X等位基因26%，x等位基因74%。ER－α(XbaⅠ)各基因型組間膽固醇水平不存在差異。見表6。

表6 ER-α(XbaⅠ)等位基因之間血清生化的比較〔M(QR)，mmol/L〕

2.4 ER－α(PvuⅡ)基因型 ER－α 基因(PvuⅡ)基因型分為(PP，pp，Pp)3型?？偣矞y(cè)定177人，其中女性132名，男性45人。PP型14.1%，pp型41.8%，Pp型 44.1%，經(jīng)檢測(cè)基因型分布符合Hardy－Weinberg平衡。等位基因分P，p種。等位基因頻率:P等位基因共為36.2%，p等位基因共為63.8%。

ER－α基因(PvuⅡ)基因型比較 LDL－Ch水平時(shí)，其中全性別、年齡＜60歲亞組等位基因組間LDL－Ch水平可能存在差異，p等位基因組LDL－Ch水平高于P等位基因組(P=0.048)，見表7。在男性、年齡≥60歲亞組中，等位基因組間HDL－Ch水平可能存在差異，p等位基因組HDL－Ch水平高低于P等位基因組(P=0.018)，見表8。

表7 ER-α(PvuⅡ)等位基因之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

表8 ER-α(PvuⅡ)等位基因之間血清生化指標(biāo)比較〔M(QR)，mmol/L〕

3 討論

APOE不同的異構(gòu)體與LDL受體的親和力也有所不同，對(duì)脂類的代謝也有不同的影響。本研究表明在石家莊社區(qū)內(nèi)，APOE的基因型可以影響到血膽固醇的含量，盡管APOE基因E4等位基因是AD的易感基因，我們的研究結(jié)果表明，在所研究的年齡段和性別中，APOE基因 E4等位基因并不伴隨著血膽固醇的升高，推測(cè)其他的基因因素也參與內(nèi)源性決定血膽固醇水平。

LDLR基因編碼存在于多種細(xì)胞膜上低密度脂蛋白受體，它的主要功能是從血液中識(shí)別和結(jié)合LDL，將它們轉(zhuǎn)入細(xì)胞。受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后被分解并釋放膽固醇，這些膽固醇被細(xì)胞利用、儲(chǔ)存或者排出體外。LDLR基因第13外顯子上存在一個(gè)AvaⅡ酶切多態(tài)性位點(diǎn)，這一位點(diǎn)的多態(tài)性與tau蛋白增多有關(guān)，而tau蛋白的腦內(nèi)異常是AD的病理變化之一，所以此多態(tài)性位點(diǎn)可能與AD有關(guān)〔7〕。本研究在分析LDLR第13外顯子(AvaⅡ)基因多態(tài)性與血生化指標(biāo)相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn):全性別(年齡≥60歲組)中，aa型LDL－Ch水平明顯高于 Aa型，這一結(jié)果更加支持了血漿中膽固醇的水平是受多基因調(diào)控的判斷。

ER－α基因包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。在第一內(nèi)含子上有兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，相差只有50 bp，分別為A/G的SNP位點(diǎn)(被限制性內(nèi)切酶XbaⅠ識(shí)別)和T/C的SNP位點(diǎn)(被限制性內(nèi)切酶PvuⅡ識(shí)別)。這兩個(gè)酶切位點(diǎn)可能對(duì)雌激素受體α的基因表達(dá)效率產(chǎn)生一定的影響〔6〕。大量臨床調(diào)查分析顯示，絕經(jīng)后婦女使用雌激素的替代治療可以有效地減少AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這提示ER對(duì)腦神經(jīng)組織具有保護(hù)作用，而ER的功能和基因表達(dá)可能會(huì)受到DNA多態(tài)性的影響。在瑞典，女性家族性AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的提高與同時(shí)攜帶ER－α基因Xba I位點(diǎn)xx基因型加APOE基因E4等位基因有關(guān)，亦和同時(shí)攜帶ER－α基因(PvuⅡ)pp基因型加APOE基因E4等位基因具有相關(guān)性〔7〕。本研究結(jié)果提示ER－α基因(PvuⅡ)等位基因除了可能調(diào)控基因表達(dá)效率外，也可能參與控制血膽固醇的水平〔8〕。

本研究膽固醇水平除與飲食因素有關(guān)外，還與基因多態(tài)性有關(guān)。我們認(rèn)為:人體存在多個(gè)決定血膽固醇水平的基因，并且基因作用所占得比重不同。這就如同“大魚”和“小魚”的關(guān)系，假如APOE基因效應(yīng)是一條“大魚”，那么其他眾多基因的作用就如同“小魚”，有一個(gè)疊加的作用。另一方面，這些基因在人生的不同時(shí)期所呈現(xiàn)的效應(yīng)不同。在個(gè)體青年時(shí)，基因效應(yīng)不明顯，當(dāng)進(jìn)入中老年期，這種基因效應(yīng)將逐漸表現(xiàn)出來。這些基因的多態(tài)性共同決定血中膽固醇水平的增齡性改變，通過持續(xù)檢測(cè)血膽固醇水平的增齡性變化和多個(gè)相關(guān)基因的多態(tài)性，也許可以為AD高危人群的超早期篩查及預(yù)防和診斷提供幫助。

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