阮國(guó)榮，肖石軍，徐 盼，劉亞軒，陳金雄，江宵兵

(1．福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350119;2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江西南昌 330045;3．福建光華百斯特生態(tài)農(nóng)牧有限公司，福建 尤溪 365100;4．福建省畜牧畜醫(yī)總站，福建 福州 350003)

隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化、專業(yè)化水平的不斷提高，培育杜洛克、長(zhǎng)白、大白等主流商業(yè)品種內(nèi)各具特色的專門化新品系，通過(guò)配合力測(cè)定建立配套系已成為世界種豬業(yè)發(fā)展的主導(dǎo)方向，國(guó)際大型豬育種公司都已把培育多元化品系作為應(yīng)變未來(lái)不同市場(chǎng)需求的策略。鑒別和應(yīng)用重要經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因或分子標(biāo)記，建立分子標(biāo)記聚合育種、全基因組選擇等新型高效育種手段，結(jié)合常規(guī)育種技術(shù)，以配套系的形式持續(xù)選育提高引進(jìn)商業(yè)豬種，是未來(lái)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的必由之路［1－3］。

本研究選擇3個(gè)對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)具有顯著影響的主效基因位點(diǎn)，包括決定新生仔豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4ac腹瀉易感性的MUC13基因［4］，影響生長(zhǎng)速度和背膘厚的類胰島素生長(zhǎng)樣因子2(IGF2)基因內(nèi)含子3 g．3072G＞A突變［5－9］，決定氟烷敏感抗性的蘭定尼受體1(RYR1)基因 c．1843 C＞T位點(diǎn)［10－11］，采用PCR-RFLP或PCR-SNaPshot方法，在福建廈門、福清、三明、龍巖等6家大型種豬場(chǎng)的杜洛克、長(zhǎng)白、大白等引進(jìn)豬種核心育種群中，對(duì)MUC13、IGF2和RYR1基因主效突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用于各豬場(chǎng)核心群的選育改良，以期降低豬群的腹瀉發(fā)病率，提高豬產(chǎn)肉量，剔除氟烷應(yīng)激敏感基因。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自福建光華百斯特生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司、廈門國(guó)壽種豬開(kāi)發(fā)有限公司、福建永誠(chéng)畜牧有限公司、龍巖市龍馬畜牧飼料有限公司種豬場(chǎng)、龍巖市萬(wàn)龍?jiān)N豬發(fā)展有限公司、龍巖市晨興養(yǎng)殖有限公司等6家種豬場(chǎng)。樣本總數(shù)1 879頭，其中杜洛克629頭，長(zhǎng)白627頭，大白623頭。采樣時(shí)將待檢測(cè)豬的耳尖用酒精消毒后，用耳號(hào)鉗剪取耳組織樣品2～3 g，放入盛有體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的1．5 mL Eppendorf管內(nèi)，低溫保存。采用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇法提取基因組DNA，統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL。

1．2 基因型判定

PCR引物由上海生工生物有限公司合成。各主效基因位點(diǎn)的引物序列及其判型方法見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系總體積為 20 μL，包括模板 DNA 40 ng，10 × buffer 2．0 μL，25 mmol/LMgCl21．2 μL，10 mmol/L dNTP 0．3 μL，F(xiàn)p 0．4 μL，Rp 0．4 μL，Taq 聚合酶 0．5 μL，超純水 13．2 μL。PCR 循環(huán)參數(shù):94℃變性3 min，94℃ 30 s，退火溫度(表1)30 s，72℃延伸45 s，共36個(gè)循環(huán)。

表1 PCR引物及其判型方法Tab．1 PCR primer and genotyping methed

1．2．1 PCR－SNaPshot法 采用PCR-SNaPshot判定MUC13和IGF2基因型，反應(yīng)體系為5 μL，包含1．5 μL 純化后PCR 產(chǎn)物，2 μL SNaPshot multiplexmix(含Taq聚合酶和熒光標(biāo)記的dd －NTPs)，1．2 μL 去離子水，0．3 μL SNaPshot引物。SNaPshot反應(yīng)體系的擴(kuò)增程序?yàn)?96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)。然后，在SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物中加0．57 μL 1 × NEB buffer和0．1 μL的CIP純化酶，37℃反應(yīng)60 min以清除熒光標(biāo)記的ddNTPs，隨后75℃反應(yīng)15 min滅活純化酶。最后，每1 μL SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物加8 μL Hi-Di formamide與GeneScan 120 LiZ size standard混合物(兩者比例為20∶1)，經(jīng)變性后上樣于 ABI 3130XL 遺傳分析儀(ABI，USA)進(jìn)行電泳，利用 GeneMapper Software version 4．0(ABI，USA)進(jìn)行基因型判定和數(shù)據(jù)收集。

1．2．2 PCR－RFLP法 利用 Hha I PCR-RFLP法檢測(cè) RYR1．c．1843 C＞T位點(diǎn)的基因型，PCRRFLP檢測(cè)酶切反應(yīng)體系及條件為:PCR產(chǎn)物6 μL，Hha I內(nèi)切酶1U(NEB，英國(guó))，酶切緩沖液1．5 μL，加水至總體積為15 μL。37℃水浴4 h以上或過(guò)夜。當(dāng)RYR1基因型為NN時(shí)，Hha I可將PCR擴(kuò)增的659 bp特異片段酶切成493 bp和166 bp兩條帶;當(dāng)HAL基因型為nn時(shí)，HhaI限制酶識(shí)別位點(diǎn)消失，電泳后只有659 bp 1條帶;當(dāng)HAL基因型為Nn時(shí)，可以觀察到659 bp、493 bp、166 bp 3條帶。

2 結(jié)果與分析

2．1 MUC13基因的基因頻率和基因型頻率

各品種的MUC13基因型頻率及基因頻率的分布見(jiàn)表2。結(jié)果表明，各品種均有一定程度的有利等位基因，杜洛克有利(抗性)等位基因頻率最高，達(dá)0．892。

表2 各品種MUC13基因的基因型頻率和基因頻率Tab．2 The genotype and allele frequency of MUC13 in the tested breed

2．2 IGF2基因的基因頻率和基因型頻率

各品種IGF2 intro3 g．3072G＞A基因型頻率及基因頻率的分布見(jiàn)表3。結(jié)果表明:杜洛克群體有利基因頻率為0．933，A等位基因在杜洛克中已基本純合，這與Objeda等［12］研究結(jié)果一致。長(zhǎng)白豬和大白豬均有較高的A等位基因頻率，分別為0．742和0．826。

表3 各品種IGF2基因的基因型頻率和基因頻率Tab．3 The genotype and allele frequency of IGF2 in the tested breed

2．3 RYR1基因的基因頻率和基因型頻率

各品種RYR1 c．1843 C＞T基因型頻率及基因頻率的分布見(jiàn)表4。結(jié)果表明:各品種群體均有極高的有利基因型頻率，僅有1家豬場(chǎng)有1頭nn基因型氟烷應(yīng)激個(gè)體;每個(gè)豬場(chǎng)杜洛克、長(zhǎng)白、大白群體有少量的Nn基因型雜合子，以杜洛克群體Nn基因型個(gè)體比例為高，達(dá)10．2%。

表4 各品種RYR1基因的基因型頻率和基因頻率Tab．4 The genotype and allele frequency of RYR1 in the tested breed

2．4 不同品種RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布

杜洛克、長(zhǎng)白、大白豬群RYR1、IGF2與 MUC13基因型組合分布見(jiàn)圖 5，6，7。

結(jié)果表明:在所檢測(cè)的群體

中，杜洛克豬群 RYR1、IGF2、MUC13基因均為有利基因型組合NN/AA/GG的個(gè)體數(shù)為212頭，占群體總量的65．4%(212/324);長(zhǎng)白豬群有利基因型組合

NN/AA/GG的個(gè)體數(shù)為73頭，占群體總量的19．9%(73/367);大白豬群有利基因型組合NN/AA/GG的個(gè)體數(shù)為143頭，占檢測(cè)群體總量的 28．4%(143/503)。

3 討論

3．1 關(guān)于MUC13基因的選育

斷奶前仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見(jiàn)疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)保守估計(jì)，我國(guó)每年至少有1 000萬(wàn)頭斷奶前仔豬腹瀉致死病例，由此

圖1 杜洛克豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．1 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in duroc pigs

圖2 長(zhǎng)白豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．2 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in landrace pigs

造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。而產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4ac是引發(fā)斷奶前仔豬腹瀉的最主要致病菌。江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地自2002年以來(lái)，通過(guò)全基因組連鎖定位分析、目的區(qū)域的斷點(diǎn)重組分析和遠(yuǎn)緣群體的高通量SNPs標(biāo)記關(guān)聯(lián)性分析等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪z傳研究手段，確定了MUC13為決定斷奶前仔豬腹瀉易感性的ETEC F4ac受體基因。通過(guò)來(lái)自292頭純種及1 315雜種個(gè)體的屠宰測(cè)定驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了對(duì)ETEC F4ac易感和抗性個(gè)體鑒別準(zhǔn)確率大于97%的關(guān)鍵突變位點(diǎn)，由此建立了高精準(zhǔn)度的、具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的斷奶前仔豬腹瀉抗病育種新技術(shù)。

本研究對(duì)MUC13的關(guān)鍵變異位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，杜洛克群體有利(抗性)等位基因頻率很高，這與生產(chǎn)上杜洛克種豬腹瀉比例總體較低現(xiàn)狀吻合，杜洛克豬群只需進(jìn)行少量個(gè)體的淘汰，其中AA基因型公母豬、AG基因型公豬一次性淘汰，AG基因型母豬根據(jù)生產(chǎn)性能盡量減少選留，經(jīng)過(guò)2～3個(gè)世代選育即可育成抗斷奶前ETEC F4ac腹瀉純系。長(zhǎng)白、大白豬群不利等位基因頻率較高，表明需要經(jīng)過(guò)多世代選育，在兼顧表型選擇和性能測(cè)定的前提下，逐世代加大GG純合抗性個(gè)體的選留比例，逐步淘汰AA和GA易感型個(gè)體，使育種群中有利基因頻率加大，以增加種群對(duì)仔豬腹瀉的抗性。

現(xiàn)場(chǎng)選種實(shí)踐中，為了提高新生仔豬腹瀉抗性，建議采用兩階段選育的育種策略。在仔豬出生時(shí)采集耳樣進(jìn)行MUC13基因檢測(cè)，根據(jù)基因型選擇合適數(shù)量的群體進(jìn)行性能測(cè)定，性能測(cè)定結(jié)束后，利用個(gè)體性能測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)合系譜信息，根據(jù)EBV指數(shù)的高低排序，由高至底進(jìn)行選種。具體選配時(shí)優(yōu)先選擇抗性公豬配種;需要使用易感公豬時(shí)，盡量使用雜合子個(gè)體;盡量避免抗性母豬與易感公豬配種。然而，仔豬腹瀉受多種因素影響(細(xì)菌/病毒/寄生蟲(chóng)/營(yíng)養(yǎng)/飼養(yǎng)管理)，在開(kāi)展基因育種的同時(shí)，仍需兼顧免疫、飼料和環(huán)境控制等方面，以進(jìn)一步降低仔豬(特別是斷奶仔豬)腹瀉的發(fā)病率。

圖3 大白豬群RYR1、IGF2與MUC13的基因型組合分布圖Fig．3 Distribution of RYR1，IGF2，MUC13 genotype combinations in large white pigs

3．2 關(guān)于IGF2基因的選育

杜洛克、長(zhǎng)白、大白是目前我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中的主流商業(yè)豬種，均為高度選育品種，特別在產(chǎn)肉性能方面經(jīng)歷了強(qiáng)選擇壓力。本研究揭示IGF2增加產(chǎn)肉量的有利基因頻率在這些品種中的頻率較高，符合品種的選育歷史現(xiàn)狀。在選育過(guò)程中，對(duì)于專門化父系，建議淘汰GG型個(gè)體，GA個(gè)體若是母豬可以保留;若是公豬，在條件許可的情況下予以淘汰。通過(guò)2～3個(gè)世代的選育，有望將有利等位基因A在種群中固定。在純繁或雜交生產(chǎn)商品豬時(shí)，盡量選擇AA型公豬個(gè)體，以提高后代的生長(zhǎng)性能。

Stinckens等［13］在大規(guī)模生產(chǎn)母豬群體(包括555頭來(lái)自合成系母豬以及111 330頭純種長(zhǎng)白母豬)中開(kāi)展了IGF2基因g．3073 G＞A的檢測(cè)及其與母豬繁殖性狀的相關(guān)性分析，結(jié)果表明來(lái)自父本的有利于肌肉生長(zhǎng)和瘦肉率的AA等位基因型與母豬的產(chǎn)仔數(shù)及使役年限呈顯著負(fù)相關(guān)，并推測(cè)這種負(fù)面效應(yīng)可能是由于瘦肉率的增加和低脂肪沉積所致。該研究揭示了IGF2基因QTN(g．3073 G＞A)效應(yīng)對(duì)于種母豬具有兩面性:一方面能夠增加胴體瘦肉率與降低背膘厚，另一方面會(huì)造成母豬的產(chǎn)仔數(shù)及使役年限的下降?；诖?，針對(duì)IGF2基因的專門化品系選育最佳模式為:父系應(yīng)該持續(xù)選留能夠增加瘦肉率的AA基因型個(gè)體，而母系應(yīng)該選擇能夠提高母豬繁殖力的GG型個(gè)體。由于IGF2基因?yàn)楦副居≯E基因［14－15］，來(lái)自于母本的G等位基因在后代中被沉默，因而不會(huì)影響商品代個(gè)體的瘦肉率。采用這種模式進(jìn)行配套系選育時(shí)，最終的商品豬既可提高生長(zhǎng)速度，又可兼顧產(chǎn)仔數(shù)。本研究中的IGF2 g．3073 G＞A的檢測(cè)結(jié)果將有利于受試種群的分化定向選育改良。

3．3 關(guān)于RYR1基因的檢測(cè)

在本研究中，各受試群體的氟烷敏感抗性基因頻率很高，但一部分群體仍存在一定頻率的敏感基因攜帶者，特別是部分杜洛克群體，這與采樣調(diào)研時(shí)所了解到的種豬曾引進(jìn)過(guò)臺(tái)系杜洛克或摻有皮特蘭血緣的杜洛克品系有關(guān)。根據(jù)本檢測(cè)結(jié)果，各采樣場(chǎng)杜洛克、長(zhǎng)白、大白種群盡量選留NN基因型進(jìn)行純種繁育，可建立氟烷敏感應(yīng)激陰性豬群。

3．4 關(guān)于多基因聚合育種

RYR1、IGF2與MUC13的NN/AA/GG有利等位基因型組合個(gè)體比例在各豬場(chǎng)、各品種差異較大，以杜洛克群的65．4%為最高，大部分小于20%，由此可見(jiàn)，在兼顧表型和性能測(cè)定的情況下，需經(jīng)過(guò)多世代選育才能達(dá)到將此三個(gè)主效位點(diǎn)有利等位基因選育純合的目的，杜洛克選育較之大白、長(zhǎng)白更易于育成純合品系。

致謝:感謝廈門國(guó)壽種豬開(kāi)發(fā)有限公司、福建永誠(chéng)畜牧有限公司、福建光華百斯特生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司、龍巖市龍馬畜牧飼料有限公司種豬場(chǎng)、龍巖市萬(wàn)龍?jiān)N豬發(fā)展有限公司、龍巖市晨興養(yǎng)殖有限公司等積極協(xié)助本實(shí)驗(yàn)樣品采集;感謝江西農(nóng)業(yè)大學(xué)任軍博士對(duì)基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和論文的修改。

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