溫茹淑，鄭清梅，徐鴻飛，方展強(qiáng)

(1.嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015;2.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，工業(yè)廢水的大量排放，污染物不斷進(jìn)入到生態(tài)系統(tǒng)中，對人類的生產(chǎn)、生活及健康造成很大的影響及危害，并嚴(yán)重的威脅到自然界中各種生物的安全，日本的“水俁病”就是重金屬汞污染給人類帶來得一個警告。由此，水體重金屬污染問題越來越受到人們的關(guān)注，工業(yè)廢水把鉛、汞、鎘等大量的重金屬帶入江河湖泊，嚴(yán)重破壞了水域生態(tài)環(huán)境，直接影響依賴水環(huán)境生長的魚類的正常生長發(fā)育和繁殖。草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，草魚屬。是中國淡水養(yǎng)殖的4大家魚之一，作為重要經(jīng)濟(jì)魚類，對我國的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重大的影響。魚類早期發(fā)育是整個生活史中對各種污染物最為敏感的階段，用以作為毒性試驗具有快速、敏感、經(jīng)濟(jì)有效等特點。Na+/K+-ATPase是廣泛存在于生物細(xì)胞質(zhì)膜上，是組成Na+/K+泵活性的主要部分，對金屬離子的暴露非常敏感[1－4]。近年來不少學(xué)者開展了重金屬對草魚影響的相關(guān)研究[5－12]。本文研究了汞對草魚魚種腎臟和鰓Na+/K+-ATPase活性及其組織結(jié)構(gòu)的影響，旨在探討重金屬Hg2+對生物體的毒性作用及其機(jī)理，為水體污染的治理及漁業(yè)種質(zhì)資源和環(huán)境保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

試驗用草魚(Ctenopharyngodon idellus)魚種購自廣東梅縣丙村鎮(zhèn)某魚苗場，是同批孵化的個體。從魚池起捕后在室內(nèi)暫養(yǎng)一周后進(jìn)行實驗，馴養(yǎng)期間每天定時投喂2次。然后選擇游動活潑，體表無損傷的個體進(jìn)行試驗，平均體長為(7.3 ±1.2)cm，體質(zhì)量為(11.0 ±1.6)g。

1.2 試驗條件

暴露試驗是在容積為58 cm×38 cm×52 cm水族箱內(nèi)進(jìn)行，加入水體積為50 L，試驗用水為連續(xù)曝氣24 h的自來水，水溫(25±2)℃，pH為6.8，硬度為2.4度(德國度)，中間不更換試驗液，每組均用同樣管徑的氣頭連續(xù)充氣。每天投喂2次，試驗前2 d停止投喂，試驗期間不喂食。

1.3 暴露實驗

Hg2+對草魚魚種暴露試驗采用靜態(tài)染毒法[13]。實驗設(shè)3個質(zhì)量濃度組和一個對照組，根據(jù)溫茹淑等[5]所做的汞、鉛對草魚魚種的急性毒性研究，Hg2+對草魚魚種的96 h LC50為0.362 mg/L，3個質(zhì)量濃度設(shè)定分別取96 h LC50的1/2，1/4 和 1/8，即分別為 0.181，0.091，0.045 mg/L。試驗液的配制先用分析純氯化汞[HgCl2·2H20]配制成100 mg/L的母液儲藏備用，然后稀釋成所需要的各級不同質(zhì)量濃度。每個質(zhì)量濃度都設(shè)平行組，每組放入實驗魚35尾。試驗開始后連續(xù)觀察8 h，之后分別記錄6，12，24，48，72 h草魚的活動狀況及死亡個體數(shù)目。死亡的標(biāo)準(zhǔn)是魚腹部向上，鰓蓋停止運動，用玻璃棒輕輕刺激尾柄部位，5 min內(nèi)無反應(yīng)即可確定為個體死亡[5]。魚一旦死亡馬上取出，記錄死亡時間，魚的體表特征，并通過解剖取下死魚的鰓、腎臟、肝臟制成組織切片用以觀察組織變化。

在處理第6，12，24，48，72 h，分別從各水族箱中取出8尾草魚魚種，用鑷子尖端刺入草魚的大腦并輕輕地攪動將魚處死，剖開腹腔，去掉鰓蓋骨，取出其腎臟、鰓組織，放入預(yù)冷的生理鹽水中洗干凈血跡。將5尾草魚的樣品裝入做好標(biāo)記的1.5 mL離心管，放入－80℃超低溫冰箱，用于Na+/K+－ATPase活性的測定，將3尾草魚的樣品迅速放入做好標(biāo)記的波恩氏固定液中，并貼上標(biāo)簽，用于組織切片的制作。

1.4 Na+/K+－ATPase活性的測定

分別取試驗魚的鰓和腎組織，加人適量預(yù)冷勻漿介質(zhì)，用玻璃勻漿器在冰浴條件下進(jìn)行勻漿，勻漿液在0～4℃，3 000 r/min，離心15 min，取上清液測定Na+/K+－ATPase活性，勻漿介質(zhì)含有:蔗糖0.25 mol/L、EDTA1.25 mmol/L、Tris 10 mmol/L，pH=7.0。Na+/K+－ ATPase 活性測定參照 Paxton 等[14]方法，樣品中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法[15]。Na+/K+－ATPase酶活性單位定義為:每毫克蛋白質(zhì)每小時分解產(chǎn)生每微摩爾的無機(jī)磷的量為l個酶活性單位。

抑制率=(對照組Na+/K+－ATPase活性 －濃度組Na+/K+－ATPase活性)/對照組 Na+/K+－ATPase活性×100% (1)

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

圖表的制作采用Excel 2007軟件，實驗數(shù)據(jù)用2次重復(fù)的平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理組數(shù)據(jù)間的差異采用SPSS軟件，采用Student’s－t檢驗法進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為存在顯著性差異，P＜0.01認(rèn)為存在極顯著性差異。

1.6 組織切片制作

組織切片的制作是根據(jù)芮菊生[16]的組織切片技術(shù)的方法，進(jìn)行常規(guī)的石蠟切片，把波恩氏液固定24 h的組織塊用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精沖洗，各級乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度6～8 μm，經(jīng)蘇木精－伊紅(H.E)染色，中性膠封藏后置光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX45－32P02)觀察并用數(shù)碼相機(jī)(尼康FG－20)進(jìn)行拍照。

圖1 Hg2+對草魚魚種鰓組織Na+/K+-ATPase活性的影響Fig.1 The effect of Hg2+on the Na+/K+-ATPase activity of gills in grass carp fingerling

圖2 Hg2+對草魚魚種腎組織Na+/K+-ATPase活力的影響Fig.2 The effect of Hg2+on the Na+/K+-ATPase activity of kidney in grass carp fingerling

2 結(jié)果分析

2.1 草魚狀態(tài)及解剖觀察

試驗魚放入含汞的試驗液后表現(xiàn)興奮、不安定，在試驗液中上下竄動，快速游動。隨著時間推移，試驗魚漸趨于平靜。整個暴露實驗過程中未見死魚。在解剖過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度組的草魚魚種的體表粘液分泌增多，肝脾腫脹，肝臟的顏色變成暗紅色;腎臟充血、色澤變暗;鰓絲顏色反而變成淺紅色，且顯得腫脹。對照組的魚種未出現(xiàn)上述解剖癥狀，同時整個實驗過程中無死亡個體。

2.2 Hg2+對草魚魚種腎、鰓組織Na+/K+－ATPase活性的影響

Hg2+對草魚魚種鰓組織Na+/K+－ATPase活性的影響試驗結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，經(jīng)不同質(zhì)量濃度Hg2+處理后草魚魚種鰓組織的Na+/K+－ATPase活性變化不明顯。其中0.181 mg/L Hg2+處理12 h后，其活性基本沒變化。對于 0.045 mg/L，0.091 mg/L Hg2+處理在24 h時，酶活力都呈上升趨勢，而到72 h又呈下降趨勢。

Hg2+對草魚魚種腎組織Na+/K+－ATPase活性的影響試驗結(jié)果如圖2所示。在0.045 mg/L Hg2+溶液中曝露12 h后，Na+/K+－ATPase的活性出現(xiàn)的顯著的下降趨勢。對于 0.091 mg/L和 0.181 mg/L Hg2+試驗組Na+/K+－ATPase活性隨時間的延長出現(xiàn)平緩下降的趨勢。3個試驗組的Na+/K+－ATPase在72 h時出現(xiàn)了極顯著的下降。

圖3 Hg2+處理72 h，對草魚魚種鰓、腎Na+/K+-ATPase活性的抑制作用Fig.3 The decrease of mecury exposed 72 hours in Na+/K+-ATPase activity of Grass Carp gill and kidney

2.3 Hg2+處理 72 h，對草魚魚種腎、鰓Na+/K+－ATPase的影響比較

Hg2+暴露72 h，對草魚魚種鰓、腎Na+/K+－ATPase的影響比較結(jié)果見圖3。從圖3可看出，腎在0.045 mg/L、0.091 mg/L 和0.181 mg/L Hg2+對 Na+/K+－ATPase的抑制率均比同質(zhì)量濃度下的鰓的抑制率要大。對于0.045 mg/L Hg2+暴露6 h時，腎組織中Hg2+對Na+/K+－ATPase的抑制率達(dá)到了84.64%。可見，抑制作用是極為明顯的。

2.4 Hg2+對草魚魚種腎組織結(jié)構(gòu)的影響

魚類的腎臟在系統(tǒng)發(fā)育上屬中腎。草魚魚種的腎臟深紅色，位于前后鰾室中間，貼于體腔的背壁，以輸尿管通入膀胱，橫切面上可見腎臟外被一層結(jié)締組織膜，由許多腎小體構(gòu)成，腎小體包括腎小管(圖版Ⅰ－1，2)和腎小球(圖版Ⅰ－3)兩部分，腎小球是背大動脈分支在腎小管的腎口旁形成一個毛細(xì)血管團(tuán)(圖版Ⅰ－3)，腎小管的前端凹入，由兩層扁平的上皮細(xì)胞構(gòu)成杯狀的腎小球囊，將腎小球包入其中。腎小球囊壁分內(nèi)外兩層，兩層之間為一狹小的腔隙，稱腎小囊腔，與腎小管的管腔相通。腎臟也包含擬淋巴細(xì)胞，其細(xì)胞分布于各腎小管即由連接小管，集合小管與各血管等構(gòu)造之間。細(xì)胞甚小，其核較顯著，皆有淋巴細(xì)胞之特征(圖版Ⅰ－1，2，3)。

從組織切片觀察結(jié)果表明，對照組的腎組織無損傷，腎小體、腎小管結(jié)構(gòu)正常(圖版Ⅰ－1，2，3))。經(jīng)過 Hg2+暴露24 h，0.045 mg/L 實驗組的草魚，沒有出現(xiàn)病變的情況(圖版Ⅰ－4)，0.091 mg/L 和0.181 mg/L的實驗組草魚魚種的腎小管出現(xiàn)了萎縮的現(xiàn)象，腎小管周圍開始出現(xiàn)空腔(圖版Ⅰ－5)，腎小體組織結(jié)構(gòu)未見異常(圖版Ⅰ－6)。經(jīng)過汞暴露72 h，0.045 mg/L的實驗組中，草魚的腎臟組織結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常;0.091 mg/L及0.181 mg/L的實驗組中，腎小管均出現(xiàn)了萎縮，甚至壞死(圖版Ⅰ－7，8)，腎小體組織結(jié)構(gòu)未見異常(圖版Ⅰ－9)。

2.5 Hg2+對草魚魚種鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

圖版Ⅰ Hg2+對草魚種腎組織結(jié)構(gòu)的影響PlateⅠ Effects of Hg2+on the histological structure of kidney in grass carp

鰓是魚類的呼吸器官。鰓組織由許多從鰓弓以直角向外伸出的鰓絲組成，每個鰓絲的背面和腹面都有并排的鰓小片，是氣體交換的場所。鰓小片由上皮組織，結(jié)締組織，毛細(xì)血管及神經(jīng)組織等所組成。上皮組織位于鰓小片的基部與鰓小片的各部，是雙層細(xì)胞，兩層之間含有細(xì)胞間淋巴的空隙。鰓絲上皮具有泌氯細(xì)胞，鰓小片上皮也有，主要位于鰓絲表皮層基膜的基部，泌氯細(xì)胞起離子調(diào)節(jié)作用。鰓小片縱切其中軸有一空隙，叫毛細(xì)血管空隙，其中是毛細(xì)血管，管里充滿紅血球。小片自由擺動，細(xì)胞單層極薄，其中的紅血球通過它與水流進(jìn)行O2和CO2的交流，進(jìn)行上皮呼吸(圖版Ⅱ-1，2)。

從組織切片觀察結(jié)果表明，對照組鰓小片清晰整齊，上皮細(xì)胞之間有黏液細(xì)胞、腺細(xì)胞和泌氯細(xì)胞等，無扭曲增生現(xiàn)象，鰓組織無損傷(圖版Ⅱ-1，2)。經(jīng)過Hg2+暴露24 h后，各質(zhì)量濃度組的草魚魚種鰓小片均開始出現(xiàn)彎曲(圖版Ⅱ-3，4，5)、上皮細(xì)胞增生腫大(圖版Ⅱ-4)，相鄰的鰓小片出現(xiàn)融合等病變(圖版Ⅱ-4，5)。Hg2+暴露72 h后，鰓小片的彎曲十分明顯(圖版Ⅱ-6);有的鰓小片頂端不但腫大，甚至出現(xiàn)充血的現(xiàn)象，呈球狀或棒狀(圖版Ⅱ-6，8);上皮細(xì)胞增生，腺細(xì)胞分泌的粘液增多，相鄰的鰓絲出現(xiàn)融合現(xiàn)象，形成一片上皮細(xì)胞板(圖版Ⅱ-8);泌氯細(xì)胞腫脹，也出現(xiàn)了許多空泡;有的鰓小片甚至還出現(xiàn)了壞死和脫落(圖版Ⅱ-7)，嚴(yán)重影響了鰓的功能。這些現(xiàn)象在不同質(zhì)量濃度組的試驗魚中表現(xiàn)出的癥狀隨質(zhì)量濃度的增加而加重。

圖版Ⅱ Hg2+對草魚鰓組織結(jié)構(gòu)的影響PlateⅡ Effects of Hg2+on the histological structure of gill in grass carp

3 討論

3.1 Hg2+對草魚Na+/K+－ATPase活性影響

Na+/K+－ATPase是存在于細(xì)胞質(zhì)膜上從水解ATP獲得能量、逆電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運Na+，同時反方向轉(zhuǎn)運K+的一種內(nèi)膜蛋白，也稱鈉泵，其廣泛分布于各類細(xì)胞質(zhì)膜上。Na+/K+－ATPase酶是多種毒物作用的靶位點，對毒物十分敏感。本試驗研究的結(jié)果表明，Hg2+對草魚魚種的鰓、腎Na+/K+－ATPase的活性有抑制作用，特別是對腎Na+/K+－ATPase有明顯的抑制作用。相關(guān)研究[4]表明重金屬可以抑制Na+/K+－ATPase的活性，原因在于重金屬離子通過與膜上蛋白質(zhì)的結(jié)合位點即含巰基結(jié)構(gòu)或氧基結(jié)構(gòu)的基團(tuán)結(jié)合后，引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，這種變化阻止了底物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而抑制了正常酶的活性。而Na+/K+－ATPase的抑制對魚生理功能造成一定程度的損害，原因在于這種抑制引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，損害的部位或是質(zhì)膜或為線粒體膜，結(jié)果導(dǎo)致生物自身的代謝活動受到抑制。徐立紅等[17]通過研究表明，重金屬影響Na+/K+－ATPase的活性途徑可能與活性中心的羧基形成不溶性鹽，影響活性中心的親核催化作用;也可能取代Na+，使酶的構(gòu)象受到影響，從而影響了磷酸化步驟后面的反應(yīng)。而Thaker[2]則認(rèn)為重金屬離子對細(xì)胞的作用首先是攻擊細(xì)胞膜上的Na+，K+離子泵，導(dǎo)致了不可控制的Na+離子沿著度梯度進(jìn)入細(xì)胞中，同時水分子與其它成分一道流入細(xì)胞，最終導(dǎo)致膜的破裂。

本試驗結(jié)果中，Hg2+對腎Na+/K+－ATPase的抑制率明顯大于鰓。暴露72 h，在0.045 mg/L Hg2+處理組，鰓組織Na+/K+－ATPase的抑制率只有4.29%，腎組織Na+/K+－ATPase的抑制率為84%;在0.181 mg/L Hg2+處理組，鰓組織Na+/K+－ATPase的抑制率只有14%;腎組織Na+/K+－ATPase的抑制率為64%;表明腎組織Na+/K+－ATPase對毒物的敏感性較鰓組織的要大。這一現(xiàn)象與徐立紅等[17]的研究類似，Bouquegneau[18]用鰻的研究也發(fā)現(xiàn) Hg2+對 Na+/K+－ATPase有較強(qiáng)的抑制，Jampol[19]的研究表明，淡水魚腎中的Na+/K+－ATPase所占的比例較鰓等組織大，因此，腎ATPase要比鰓ATPase敏感些。方展強(qiáng)等[4]認(rèn)為Na+/K+－ATPase作為生物膜物質(zhì)的裝運與能量代謝的一種關(guān)鍵酶，對Hg中毒十分敏感，其活性變化可以考慮作為對水環(huán)境Hg污染效應(yīng)的較理想指標(biāo)。

3.2 Hg2+對草魚的腎臟、鰓組織結(jié)構(gòu)的毒性

腎臟是魚類排泄Hg的重要器官，是魚體內(nèi)蓄積Hg2+最多的地方，無機(jī)Hg2+進(jìn)入血液后迅速分布全身，隨之轉(zhuǎn)運、聚積在肝臟和腎臟，70%～80%的無機(jī)汞逐步以汞結(jié)合硫蛋白的形式集中在腎臟皮質(zhì)的近曲小管細(xì)胞內(nèi)，并經(jīng)腎由尿排出體外[20]。本實驗中，暴露24 h，0.045 mg/L、0.091 mg/L及暴露72 h，濃度為0.045 mg/L的草魚腎臟均未出現(xiàn)病變。其原因在于重金屬離子能在腎細(xì)胞內(nèi)與含巰基的硫蛋白結(jié)合，形成對金屬有儲存、傳遞和解毒作用的金屬硫蛋白(MT)，MT主要存在于腎小管細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)MT有足夠儲量時，可通過與重金屬離子的結(jié)合而保護(hù)腎小管細(xì)胞不受損害，從而使腎對重金屬污染表現(xiàn)出一定的耐受性[21]。但隨著Hg2+質(zhì)量濃度的增加還有暴露時間的延長，將會超出金屬硫蛋白的解毒能力，進(jìn)而直接對腎組織造成傷害。而重金屬對腎的毒性，主要是損害近曲小管的上皮細(xì)胞，使其細(xì)胞溶酶體增多，線粒體腫脹變形[20]，導(dǎo)致腎發(fā)生病變。所以在本實驗中，經(jīng)過Hg2+暴露24 h，0.181 mg/L及暴露72 h，0.091 mg/L、0.181 mg/L的草魚魚種的腎臟的腎小體無明顯的變化，但是腎小管出現(xiàn)了萎縮，細(xì)胞壞死等現(xiàn)象。且病變的程度與Hg2+質(zhì)量濃度有著密切的關(guān)系，Hg2+質(zhì)量濃度越高，病變的情況越明顯。因此，魚類腎臟的組織結(jié)構(gòu)的變化也是監(jiān)測Hg2+質(zhì)量濃度污染的一個有效標(biāo)志物。

鰓是魚類與外部環(huán)境接觸的主要器官，是外源性化學(xué)物質(zhì)的第一靶器官。魚鰓的特殊結(jié)構(gòu)決定它有利于水中離子的穿過，成為魚體直接從水中吸收重金屬的主要部位。本實驗中草魚魚種的鰓組織結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)了鰓小片腫大、充血、壞死;鰓絲融合，上皮細(xì)胞增生，腺細(xì)胞分泌的粘液增多，泌氯細(xì)胞腫脹，等一系列的病態(tài)癥狀，破壞了鰓的功能，造成魚體呼吸困難，且癥狀隨Hg2+質(zhì)量濃度的升高和暴露時間的延長而加重。這與關(guān)海紅等[22]的實驗結(jié)果是一致的。其認(rèn)為生物體內(nèi)對有害金屬的解毒機(jī)制是因體內(nèi)的金屬蛋白和類金屬巰蛋白分子的巰基(－SH)能結(jié)合大量的金屬，這兩種蛋白質(zhì)對重金屬在生物體內(nèi)的貯存、傳遞和解毒可能起著重要作用。但金屬巰蛋白的解毒作用是有限的，當(dāng)魚體內(nèi)重金屬含量過高，金屬巰蛋白不能結(jié)合的金屬便轉(zhuǎn)移到組織中的高分子量蛋白質(zhì)中，使組織受到損傷，呈現(xiàn)病理狀態(tài)，正常的生理活動受到影響。其中上皮細(xì)胞增生，泌氯細(xì)胞腫脹，被認(rèn)為是對鰓損壞引起的離子失衡而做出的補(bǔ)償性應(yīng)答[23];上皮的增生和泌氯細(xì)胞的腫張引起鰓小片融合，當(dāng)鰓絲之間的空隙被鰓絲細(xì)胞填滿，引起跨鰓表面的氧氣交換減少，呼吸困難甚至死亡[24]。

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