高淑清，張 輝，邸紅琴，趙連梅，單保恩

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011;2河北省胸科醫(yī)院)

裙帶菜(Undaria pinnatifida)是生活在海洋里的大型藻類，含有亞油酸和亞麻酸等人體必需的脂肪酸。近幾年的藥理研究表明裙帶菜多糖具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［1］，顯示了其潛在的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚。2006年10月～2008年3月，我們觀察了裙帶菜多糖對(duì)正常人外周血淋巴細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞亞群等的影響，探討其免疫機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 CO2培養(yǎng)箱(TC 2323型)為美國(guó)SHELDON公司產(chǎn)品，倒置相差顯微鏡(LH50A型)使用日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，酶標(biāo)儀(HT2型)為奧地利Anthos公司，流式細(xì)胞儀(EPICS-XL型)使用Coulter Co.Healeah，F(xiàn)L產(chǎn)品。無(wú)菌培養(yǎng)板為美國(guó)Costar公司產(chǎn)品，Lymphocytes separation medium使用上海恒信化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，MTT、DMSO和PHA購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640使用美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞亞群流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自CALTAGTM Laboratories公司。取10例健康志愿者靜脈血5mL，肝素抗凝備用。

1.2 方法

1.2.1 裙帶菜多糖提取物制備 采用多步分離法［2～4］對(duì)裙帶菜多糖的有效成分進(jìn)行分離:首先用乙醇沉淀法提取粗多糖，然后應(yīng)用葡聚糖凝膠Sephadex G-100過(guò)濾層析技術(shù)對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化。采用苯酚—硫酸顯色法鑒定純化的多糖成份。得到單一的對(duì)稱峰(見圖1)，說(shuō)明最終所得提取物為純多糖。

圖1 裙帶菜多糖粗提液經(jīng)Sephadex G-100洗脫后的多糖含量曲線

1.2.2 PBMC分離 采用Ficoll密度梯度離心法。取5 mL肝素抗凝靜脈血與等量PBS液混勻，緩慢加于5 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液面上，2 000 r/min離心20 min。取淋巴細(xì)胞加PBS液，1 500 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞2次。用含10%小牛血清的RPMI1640重懸細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞。活細(xì)胞百分率(%)=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

1.2.3 PBMC干預(yù)及增殖活性檢測(cè) 取分離的PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為21×106/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/每孔。每孔加入 PHA 1 μL(1 mg/mL)，使各孔PHA終濃度為5 μg/mL。觀察組分別加入0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙帶菜多糖，各設(shè)三個(gè)復(fù)孔;對(duì)照組僅加入PBS。用RPMI1640調(diào)整每孔終體積為200 μL。將培養(yǎng)板置于飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。各培養(yǎng)孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)上清，每孔加入 DMSO 100 μL，振蕩器震蕩反應(yīng) 15 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以測(cè)定波長(zhǎng)570 nm檢測(cè)各孔光密度(OD)值。

1.2.4 PBMC干預(yù)及淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)檢測(cè) 取分離的PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶 2 mL。分別加入 0、0.5、5、20、100、500 μg/mL 的裙帶菜多糖 25 μL。同時(shí)，每瓶各加 PHA 5 μL(1 mg/mL，終濃度為 1 μg/mL)，用RPMI1640補(bǔ)足每瓶終體積為5 mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收獲各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS洗1遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為51×106/mL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC中淋巴細(xì)胞亞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBMC 增殖活性 觀察組 0.5、5、20、100、500 μg/mL 干預(yù)后OD 值分別為0.136 ±0.036、0.191 ±0.023 、0.216 ± 0.007、0.193 ± 0.009、0.165 ±0.012，與對(duì)照組(0.106 ±0.006)比較，P 均 ＜0.01。2.2 淋巴細(xì)胞亞群 見表1。

表1 兩組淋巴細(xì)胞亞群水平(n=10，%，±s)

表1 兩組淋巴細(xì)胞亞群水平(n=10，%，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與0.5 μg/mL 比較，▲P ＜0.05

組別 CD4+ CD8+ CD19+ CD16+CD56+觀察組0.5 μg/mL 49.50 ±1.80 24.67 ±1.53* 3.80 ±1.53 4.17 ±0.76 5.0 μg/mL 49.60 ±1.76 30.87 ±2.08△▲3.33 ±2.08 9.33 ±1.53△▲20.0 μg/mL 48.98 ±3.21 34.67 ±2.52△▲3.67 ±1.53 9.67 ±1.53△▲100.0 μg/mL 49.31 ±4.53 28.33 ±2.10△▲3.68 ±2.00 6.70 ±1.44△▲500.0 μg/mL 48.99 ±2.62 28.10 ±5.00＊▲3.80 ±2.69 5.50 ±1.80△對(duì)照組49.30 ±4.00 21.33 ±4.04 3.78 ±2.00 3.01 ±1.73

3 討論

裙帶菜為褐藻門昆布屬，是經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值較高的大型藻類，營(yíng)養(yǎng)豐富。裙帶菜孢子葉含人體必需的八種氨基酸及亞油酸、亞麻酸等人體必需的脂肪酸(其中二十碳五烯酸占脂肪酸含量的15% ～20%)。另外，裙帶菜富含鈣、鎂、鐵等多種無(wú)機(jī)元素，是人體所需要的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。被譽(yù)為海中的蔬菜、餐桌上的綠色保健食品。本研究采用多步分離法分離純化了裙帶菜多糖活性成分，裙帶菜多糖作為裙帶菜中的重要活性成分，研究其免疫學(xué)活性及作用機(jī)制具有十分重要的意義。本研究顯示，裙帶菜多糖可明顯增強(qiáng)PHA刺激的PBMC增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，隨裙帶菜多糖濃度的增加，PBMC增殖反應(yīng)逐漸增強(qiáng)。但當(dāng)裙帶菜多糖濃度增加到一定值時(shí)(100 μg/mL)，PBMC增殖又逐漸減弱。這可能是由于淋巴細(xì)胞在高濃度的裙帶菜多糖環(huán)境下，受到來(lái)自滲透壓、pH等的不利影響，而使細(xì)胞受到損害，從而影響細(xì)胞的存活和增殖。與以往的報(bào)道一致［5］。

CD8+T細(xì)胞主要包含兩類細(xì)胞即Ts細(xì)胞(抑制性T細(xì)胞)和CTL(殺傷性T細(xì)胞)。Ts細(xì)胞作用的靶細(xì)胞主要是抗原特異性的Th和B細(xì)胞，其作用除了引起細(xì)胞免疫應(yīng)答外，還可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體;CTL的主要生物學(xué)主要為參與細(xì)胞免疫、抗腫瘤免疫及移植排斥反應(yīng)。NK細(xì)胞是一種非特異性、具有細(xì)胞毒性的免疫細(xì)胞群，在宿主的免疫監(jiān)視功能中具有重要作用。該細(xì)胞無(wú)需抗原預(yù)先致敏，就能自發(fā)地殺傷靶細(xì)胞，主要功能是參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染中均起重要作用。NK細(xì)胞的抗腫瘤活性依賴KIR區(qū)域和TRAU區(qū)域介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這兩個(gè)激活和抑制性受體的調(diào)節(jié)和平衡是腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)［6］。Maruyama 等［7］對(duì)裙帶菜孢予葉中提取的巖藻聚糖進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖糖能夠提高Thl細(xì)胞應(yīng)答及IFN-γ和IL-12產(chǎn)生，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，裙帶菜多糖刺激PBMC增殖后，各淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)發(fā)生明顯改變。其中CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例明顯增高，CD4+T細(xì)胞雖有增加趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，B細(xì)胞無(wú)明顯變化。提示裙帶菜多糖通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫而非體液免疫功能發(fā)揮免疫作用。

綜上所述，裙帶菜多糖能夠促進(jìn)人PBMC淋巴細(xì)胞增殖并對(duì)淋巴細(xì)胞亞群水平產(chǎn)生有益的影響。增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能可能是裙帶菜多糖治療腫瘤機(jī)制之一。關(guān)于裙帶菜多糖對(duì)細(xì)胞因子分泌、體液免疫功能的影響、體內(nèi)作用效果、抗腫瘤作用等有待于進(jìn)一步研究。

［1］付小梅，高淑清，孫俠，等.裙帶菜的生理藥理作用研究進(jìn)展［J］.癌變·畸變·突變，2004，16(4):254-256.

［2］王北嬰，李儀奎.中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001:735-749.

［3］李亞清.小球藻多糖的分離純化和組成分析［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21(3):56-59.

［4］周文蘭，童列波.苯酚—硫酸法測(cè)定康克膠囊中多糖含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001，12(7):505.

［5］胡國(guó)俊，白惠卿，杜守英.枸杞對(duì)TB淋巴細(xì)胞增殖和T細(xì)胞亞群變化的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，1995，11(3):163-165.

［6］Klinge N，Mann H，Boissel L.Targeted cellular therapy with natural killer cells［J］.Horm Metab Res，2008，40(2):122-125.

［7］Mamyama H，Tamauehi L，Hashimoto M，et al.Antitumor activity and immune response of mekabu fueoidan extracted from sporophy U of undaria pinnatifida［J］.In Vivo，2003，17(3):245.