胡 婷，陳梅香，閆雍容，鐘雪云

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣州 510632;2廣州醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院)

大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。近年來，發(fā)現(xiàn)了一類在真核生物中起轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的小分子、非編碼RNA(miRNA)，在細(xì)胞正常生長發(fā)育、增殖、分化與凋亡等生命活動中具有重要作用。研究證實，miRNA在腫瘤中異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因參與大腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、遷移，并與腫瘤的診斷和預(yù)后等密切相關(guān)。具有原癌基因作用的miR-21在大腸癌中常呈過度高表達(dá)狀態(tài)［1］，其能影響細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等，但miR-21在大腸癌侵襲和遷移過程中的作用機制尚不清楚。為此我們于2010年9月～2011年11月進(jìn)行了如下研究。

1 材料和方法

1.1 材料 Trizol試劑購自Invitrogen公司;Prime-ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaTM熒光定量PCR試劑盒均購自Takara公司;miR-21和U6 snRNA的Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set由廣州銳博公司合成;miR-21 mimics和 miRNA mimics negative control購自上海吉瑪公司;jetPRIMETMTransfection Reagent購自Polyplus Transfection公司;24孔Transwell小室購自美國Corning公司;Matrigel購自BD公司;緊密連接蛋白(ZO-1)、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cad)、Slug、第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔抗人單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司;0.45 μm硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司;β-肌動蛋白(β-Actin)鼠抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG皆購自Protein Tech Group公司;BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自海門碧云天公司;ECL底物發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480為本實驗室凍存保藏，用含10%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的SW480細(xì)胞消化計數(shù)，5.0×105/孔接種于6孔板中。轉(zhuǎn)染組加入終濃度為30 nmol/L 的 miR-21 mimics、200 μL jetPRIMETMBuffer和4 μL jetPRIMETMreagent(轉(zhuǎn)染組);對照組是將miR-21 mimics換為同濃度的miRNA mimics negative control，余同實驗組，轉(zhuǎn)染步驟按說明書操作;兩組均用含5%FBS RPMI-1640調(diào)至2 mL。24 h后將培養(yǎng)液換為10%FBS RPMI-1640。

1.2.2 觀察項目

1.2.2.1 miR-21表達(dá) 采用 RFQ-PCR 法。用 Trizol提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)分光光度計檢測，A260/A280值為1.8～2.1的用于cDNA合成。RT反應(yīng):用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、按說明書進(jìn)行RT反應(yīng)，62.5 nmol/L miR-21 及U6 Bulge-LoopTM miRNA RT Primer各2 μL，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37℃ 15 min、85℃ 5 s。RFQ-PCR:反應(yīng)體系 20 μL，SYBR Premix Ex TaTM 10 μL，5 μmol/L Bulge-LoopTM miR-21或U6 snRNA上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，無酶水7 μL，反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性20 s，之后95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。采用2－ΔΔCt評定不同細(xì)胞中miR-21相對表達(dá)量，ΔCt=CtmiR-21－CtU6，ΔΔCt=ΔCtmiR-21mimics－ΔCtnegative control。

1.2.2.2 細(xì)胞遷移和侵襲能力 將 Matrigel用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按1∶1比例配制成細(xì)胞外基質(zhì)膠，按30 μL/室加入Transwell小室聚碳酸酯膜(直徑6.5 mm，孔徑 8 μm)上面，包被細(xì)胞外基質(zhì)膠。轉(zhuǎn)染24 h后，用2.5%胰酶消化，懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。細(xì)胞遷移試驗:用未包被細(xì)胞外基質(zhì)膠的Transwell小室，在小室的上室中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室中加入600 μL含10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育14 h;細(xì)胞侵襲試驗:用聚碳酸酯膜包被了細(xì)胞外基質(zhì)膠的Transwell小室，在小室的上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中孵育24 h，余同遷移試驗。每組設(shè)3個平行孔，實驗重復(fù)3次。孵育結(jié)束后，擦除小室濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定、PBS輕洗、0.1%結(jié)晶紫染色，200倍顯微鏡下分別計數(shù)穿過膜的細(xì)胞(遷移細(xì)胞及侵襲細(xì)胞)并拍照，隨機選取5個視野，取其平均值。

1.2.2.3 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用 Western blot法。收集細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)樣品。用BCA法在酶標(biāo)儀上用570 nm波長測定總蛋白濃度。樣本經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用電轉(zhuǎn)儀以350 mA恒流1 h轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。用Image J軟件分析條帶的強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，兩組之間均數(shù)的比較采用獨立樣本的t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21表達(dá) 轉(zhuǎn)染組及對照組miR-21相對表達(dá)量分別為 2185.62 ±69.75、1.00 ±0.00(P ＜0.001)。

2.2 細(xì)胞的遷移和侵襲能力 遷移試驗中，對照組細(xì)胞數(shù)為(90.4±10.26)個，轉(zhuǎn)染組為(181.0±22.16)個 ，P ＜0.001;侵襲試驗中，對照組細(xì)胞數(shù)為(73.8 ±9.2)個，轉(zhuǎn)染組為(148.0 ±7.31)個 ，P ＜0.001。

2.3 相關(guān)蛋白表達(dá) 見圖1。由圖1可見，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ZO-1、E-cad、PTEN表達(dá)量明顯下降(P ＜0.001)，而 N-cad、Slug、p-Akt表達(dá)量卻明顯升高(P ＜0.001)。

3 討論

圖1 各相關(guān)標(biāo)志物電泳圖

復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響大腸癌患者術(shù)后生存率的關(guān)鍵要素。大腸癌轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，與胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移運動及信號傳導(dǎo)等諸多因素有關(guān)，具體機制尚不清楚。新近發(fā)現(xiàn)的miRNA在細(xì)胞的分化、增殖、代謝及胚胎發(fā)育等生命活動中具有重要作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程中也具有重要作用。自1993年Lee等發(fā)現(xiàn)第一個miRNA以來，miRNA基因序列數(shù)據(jù)庫現(xiàn)已收錄動植物及病毒等成熟miRNA 18 226條，其中人類的為1 527條。人類成熟miRNA至少調(diào)控著30%人類蛋白質(zhì)編碼基因。miRNA可通過完全互補或部分互補的方式與靶mRNA相互作用，一種miRNA可作用于多種靶mRNA，多個miRNA也可協(xié)同作用于同一個靶 mRNA［2］。miRNA可能是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，亦可能是腫瘤治療的有效新靶點。

目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在大腸癌組織及大腸癌細(xì)胞系中異常表達(dá)。在大腸癌組織中，miR-19a、miR-21、miR-29a、miR-92、miR-148a、miR-200b 等的表達(dá)明顯上調(diào)，而 miR-30c、miR-133a、miR-143 和miR-145 等的表達(dá)明顯下調(diào)［1］。miR-320a、Let-7c和miR-137 等可抑制大腸癌的侵襲和遷移［3，4］，miR-31、miRNA-200家族和miR-21等可促進(jìn)大腸癌侵襲和遷移［5～7］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)顯著上調(diào);細(xì)胞的遷移和侵襲能力皆明顯增強，說明 miR-21能增強大腸癌SW480細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Han等［8］發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過誘導(dǎo) EMT促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的情況下喪失細(xì)胞極性向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。EMT是胚胎時期三胚層、器官形成等所必須的生理過程，亦常見于慢性炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)與組織纖維化、以及惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等病理過程。EMT的發(fā)生涉及多個環(huán)節(jié)，包括細(xì)胞因子(TGF-β、HGF)和轉(zhuǎn)錄因子(Snail、Slug、Twist等)表達(dá)上調(diào)，上皮標(biāo)志物(E-cad、ZO-1等)表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物(波形蛋白Vimentin、N-cad等)表達(dá)上調(diào)，有輔助作用的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等表達(dá)上調(diào)。其中E-cad表達(dá)下調(diào)是EMT發(fā)生中最重要的分子事件。越來越多的證據(jù)表明EMT是多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期的一個重要過程［9］。在多種實體腫瘤中，腫瘤中央的細(xì)胞呈上皮表型，而周邊的細(xì)胞多呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，其黏附能力下降、遷移運動能力增強、易于離開原有位置、發(fā)生原位浸潤或侵入血管和淋巴管而發(fā)生轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-21表達(dá)的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，上皮標(biāo)志物ZO-1和E-cad的表達(dá)皆明顯低于對照組，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cad表達(dá)卻明顯高于對照組，核轉(zhuǎn)錄因子Slug表達(dá)亦明顯高于對照組。Slug是鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族中的一員，可與E-cad的啟動子結(jié)合而抑制E-cad的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。上述結(jié)果提示，SW480細(xì)胞中上調(diào)的miR-21可能是通過激活Slug，繼而下調(diào)E-cad和ZO-1的表達(dá)、上調(diào)N-cad的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。

Zhang等［10］發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞 BGC-823 中，miR-21可通過靶向PTEN促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲［10］。在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中抑癌因子PTEN是miR-21的直接靶標(biāo)［11］。在人大腸癌細(xì)胞中miR-21能否靶向抑制PTEN尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-21表達(dá)后SW480細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，而p-Akt蛋白表達(dá)卻明顯升高。Yao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在人類腎臟近端小管上皮細(xì)胞系中，過表達(dá)PTEN可以抑制TGF-β誘導(dǎo)EMT的形成。Song等［13］在人鼻咽癌上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制PTEN蛋白表達(dá)可增強細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PTEN是磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。以上結(jié)果和資料表明，在大腸癌細(xì)胞中上調(diào)miR-21可抑制PTEN蛋白表達(dá)，激活PI3K/Akt通路，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移。然而，miR-21的靶基因可能具有組織細(xì)胞特異性，在大腸癌細(xì)胞中PTEN是否是miR-21的直接靶標(biāo)，仍需進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌中，miR-21也可靶向抑制抑癌因子程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)和RhoB，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲［7，14］。一種 miRNA可作用于多種靶mRNA，目前已發(fā)現(xiàn)，miR-21還可靶向抑制抑癌因子Maspin、PTEN、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子Kazal基序逆向誘導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白(rRECK)、金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)、異質(zhì)核核糖核體蛋白 K(HNRPK)、TAp63、p53、豆蔻酰化富丙氨酸蛋白激酶C底物(MARCKS)、富亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋白1(LRRFIP1)、CC亞族趨化因子配體20(CCL20)等多種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，參與調(diào)節(jié) p53、TGF-β、線粒體凋亡、核因子-κB(NF-κB)、PI3K/Akt、Bcl-2、表皮生長因子受體等通路［15，16］?？傊?，miR-21作為一種致癌基因可參與調(diào)節(jié)多條信號通路中多種腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的生長、遷移和侵襲等;miR-21可能是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點及惡性腫瘤治療的有效靶標(biāo)，靶作用于miR-21或許能夠?qū)崿F(xiàn)“單擊多靶”效應(yīng)。

［1］Bandrés E，Cubedo E，Agirre X，et al.Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues［J］.Mol Cancer，2006，5:29-38.

［2］Lim LP，Lau NC，Garrett-Engele P，et al.Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs［J］.Nature，2005，433(7027):769-773.

［3］Zhang Y，He X，Liu Y，et al.microRNA-320a inhibits tumor invasion by targeting neuropilin1 and is associated with liver metastasis in colorectal cancer［J］.Oncol Rep，2012，27(3):685-694.

［4］Han HB，Gu J，Zuo HJ，et al.Let-7c functions as a metastasis suppressor by targeting MMP11 and PBX3 in colorectal cancer［J］.J Pathol，2012，226(3):544-555.

［5］Wang CJ，Stratmann J，Zhou ZG，et al.Suppression of microRNA-31 increases sensitivity to 5-FU at an early stage，and affects cell migration and invasion in HCT-116 colon cancer cells［J］.BMC Cancer，2010，10:616-626.

［6］Burk U，Schubert J，Wellner U，et al.A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells［J］.EMBO Rep，2008，9(6):582-589.

［7］Asangani IA，Rasheed SA，Nikolova DA，et al.MicroRNA-21(miR-21)post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal cancer［J］.Oncogene，2008，27(15):2128-2136.

［8］Han M，Liu M，Wang Y，et al.Re-expression of miR-21 contributes to migration and invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition consistent with cancer stem cell characteristics in MCF-7 cells［J］.Mol Cell Biochem，2012，363(1-2):427-436.

［9］Gos M，Miloszewska J，Przybyszewska M.Epithelial-mesenchymal transition in cancer progression［J］.Posteby Biochem，2009，55(2):121-128.

［10］Zhang BG，Li JF，Yu BQ，et al.microRNA-21 promotes tumor proliferation and invasion in gastric cancer by targeting PTEN［J］.Oncol Rep，2012，27(4):1019-1026.

［11］Roy S，Khanna S，Hussain SR，et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue［J］.Cardiovasc Res，2009，82(1):21-29.

［12］Yao Y，Wei H，Liu L，et al.Upregulated DJ-1 promotes renal tubular EMT by suppressing cytoplasmic PTEN expression and Akt activation［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31(4):469-475.

［13］Song LB，Li J，Liao WT，et al.The polycomb group protein Bmi-1 represses the tumor suppressor PTEN and induces epithelial-mesenchymal transition in human nasopharyngeal epithelial cells［J］.J Clin Invest，2009，119(12):3626-3636.

［14］Liu M，Tang Q，Qiu M，et al.miR-21 targets the tumor suppressor RhoB and regulates proliferation，invasion and apoptosis in colorectal cancer cells［J］.FEBS Lett，2011，585(19):2998-3005.

［15］Pan X，Wang ZX，Wang R.MicroRNA-21:a novel therapeutic target in human cancer［J］.Cancer Biol Ther，2011，10(12):1224-1232.

［16］Vicinus B，Rubie C，F(xiàn)aust SK，et al.miR-21 functionally interacts with the 3＇UTR of chemokine CCL20 and down-regulates CCL20 expression in miR-21 transfected colorectal cancer cells［J］.Cancer Lett，2012，316(1):105-112.