尹春麗,曹珊珊,牛衛(wèi)寧

(1.西安文理學(xué)院生命科學(xué)系，陜西 西安 710065;2.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,陜西 西安 710072)

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種活性小分子，在體內(nèi)SAM是由三磷酸腺苷(ATP)和L-甲硫氨酸(L-Met)經(jīng)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosylmethionine synthetase)催化合成[1]。在歐洲，SAM已作為處方藥廣泛用于肝病、抑郁癥、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療；在美國，SAM已經(jīng)成為一種暢銷的保健品[2～4]；在我國，SAM的市場需求不斷增長，但售價(jià)昂貴。因此，建立廉價(jià)高效的SAM生產(chǎn)工藝是SAM大規(guī)模推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。

目前，SAM的生產(chǎn)方法主要為酵母菌發(fā)酵法，存在生產(chǎn)周期長、底物轉(zhuǎn)化率低、純化工藝復(fù)雜、能耗高等缺點(diǎn)，而體外酶促法克服了發(fā)酵法的不足，是工業(yè)化生產(chǎn)SAM的一條新途徑。 盡管Park等[5,6]通過游離酶催化合成了SAM，但是存在酶無法回收重復(fù)利用的問題。牛衛(wèi)寧等[7，8]構(gòu)建了高效表達(dá)SAM合成酶的重組大腸桿菌(E.coli)JM109(pBR322-SAMS)，重組菌酶活性比原始菌提高了157倍。

與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性大幅提高。同時(shí)，固定化酶與反應(yīng)產(chǎn)物可以通過離心或過濾等簡單方式加以分離，有利于酶的多次重復(fù)使用及產(chǎn)品的純化。海藻酸鈉安全無毒、價(jià)廉易得，用它與鈣鹽形成的凝膠來包埋SAM合成酶，具有反應(yīng)條件溫和、操作簡單、不改變酶蛋白結(jié)構(gòu)、酶活力損失小等優(yōu)點(diǎn)。作者在此對海藻酸鈉固定化SAM合成酶的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)研究了固定化SAM合成酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在SAM合成中的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

重組菌株E.coliJM109(pBR322-SAMS)，自行構(gòu)建并保存[9]。

Phenyl-Sepharose Fast Flow(1 mL)預(yù)裝柱，GE公司；S-腺苷甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；其余試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基(%)：酵母粉0.5,蛋白胨1,氯化鈉1；四環(huán)素(Tetracycline)終濃度為15 μg·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 重組SAM合成酶的表達(dá)

將重組菌E.coliJM109(pBR322-SAMS)接種到500 mL含有15 μg·mL-1四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，于30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12～16 h，使菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期，重組蛋白在大腸桿菌中可實(shí)現(xiàn)高效的組成型表達(dá)，然后于4 ℃、6000 r·min-1離心10 min，將獲得的菌體懸浮洗滌后，離心收集，備用。

1.2.2 重組SAM合成酶的純化[8]

將1 L培養(yǎng)液離心后收集的菌體用緩沖溶液清洗，加入40 mL裂解液(100 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EDTA-Na2，pH值8.0)，在冰水浴中超聲(300 W，超聲3 s，間隔5 s)處理12 min破碎菌體，將破碎液于4 ℃、10 000 r·min-1離心30 min得到上清液；在上清液中加入(NH4)2SO4固體粉末至終濃度為40%，于10 000 r·min-1離心20 min得到沉淀；沉淀用100 mmol·L-1Tris-HCl(pH值8.0)溶解并加入(NH4)2SO4至終濃度為0.75 mol·L-1，用0.22 μm濾膜過濾,備用。

將上述經(jīng)(NH4)2SO4沉淀的酶液加入到經(jīng)Buffer A[50 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EDTA-Na2，0.75 mol·L-1(NH4)2SO4，pH值8.0]預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow(1 mL)柱，流速1 mL·min-1洗脫至基線。然后用Buffer B(50 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EDTA-Na2，pH值8.0)直接洗脫得到SAM合成酶溶液。

1.2.3 固定化酶的制備

稱取1 g海藻酸鈉配制成水溶液，與一定量的SAM合成酶溶液混合后充分?jǐn)嚢琛?用6號(hào)針頭注射器將該混合溶液滴加到4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CaCl2溶液中，固定化30 min后，取出，洗凈，備用。

1.2.4 固定化酶催化合成SAM

取1 g固定化酶加到10 mL SAM合成反應(yīng)液(100 mmol·L-1Tris、100 mmol·L-1KCl、70 mmol·L-1MgSO4、40 mmol·L-1L-Met、30 mmol·L-1ATP、0.8 mol·L-1對甲基苯磺酸鈉，pH值6.5)中，于35 ℃、200 r·min-1反應(yīng)8 h，收集上清液進(jìn)行HPLC分析。

1.2.5 酶活力的測定

在3 mL反應(yīng)體系(100 mmol·L-1Tris、100 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1MgSO4、1 mmol·L-1L-Met、1 mmol·L-1ATP、0.5%β-巰基乙醇，pH值8.5)中加入適量SAM合成酶溶液，37 ℃下溫育1 h后，加入終濃度為10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸終止反應(yīng)，離心，去沉淀，上清液用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(使用SAM標(biāo)準(zhǔn)品繪制色譜峰峰面積和SAM質(zhì)量濃度之間的關(guān)系曲線)計(jì)算樣品中SAM的質(zhì)量濃度，進(jìn)而計(jì)算SAM合成酶的酶活力。以不加酶液的反應(yīng)液作空白對照。

同法測定固定化酶的酶活力。固定化酶的活力與固定化時(shí)所加游離酶總活力的比值即為固定化酶的活力回收率。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)體系下，37 ℃、1 h催化產(chǎn)生1 μmol SAM所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

HPLC色譜條件為：色譜柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長260 nm；流動(dòng)相：在900 mL純水中加入40 mmol 乙酸鈉和50 mL甲醇，用乙酸溶液調(diào)pH值至4.6，定容至1 L；流速0.6 mL·min-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 SAM合成酶的純化

菌體超聲破碎后，上清液經(jīng)40%(NH4)2SO4鹽析，離心，收集沉淀。沉淀溶解后加入(NH4)2SO4至終濃度為0.75 mol·L-1，上樣到預(yù)平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，然后直接洗脫得到SAM合成酶溶液。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 L發(fā)酵液純化得到156 mg粗酶，酶純化的活力回收率為76%，單位酶活力為30 U·mg-1。

為了降低固定化酶的成本，本研究并沒有將SAM合成酶純化至電泳純，而是使用部分純化的粗酶用于固定化研究。

2.2 SAM合成酶固定化條件的優(yōu)化

2.2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

在SAM合成酶加量(以每克海藻酸鈉計(jì)，下同)為75 mg、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、固定化時(shí)間為30 min的條件下，考察海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對SAM合成酶固定化的影響

由圖1可知，隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，固定化酶活力先上升后下降，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大。這是因?yàn)?，海藻酸鈉與Ca2+反應(yīng)形成凝膠時(shí)，凝膠的孔徑隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而縮??；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，凝膠孔徑較大，凝膠內(nèi)的酶分子容易泄露，故固定化酶活力較低；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí)，凝膠孔徑太小，此時(shí)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散受到限制，導(dǎo)致固定化酶活力下降。因此，確定海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)以3%較為適宜。

2.2.2 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

在SAM合成酶加量為75 mg、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、固定化時(shí)間為30 min的條件下，考察CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對SAM合成酶固定化的影響

由圖2可知，當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過2%時(shí)，固定化酶活力快速上升；當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大；CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，固定化酶活力反而下降。這是因?yàn)?，?dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小時(shí)，海藻酸鈉凝膠固化不充分，SAM合成酶包埋不完全，容易流失，從而導(dǎo)致固定化酶活力較低；當(dāng)CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí)，與海藻酸鈉作用形成致密的結(jié)構(gòu)，使反應(yīng)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散變得困難，導(dǎo)致固定化酶活力下降。因此，確定CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)以4%較為適宜。

2.2.3 SAM合成酶加量的確定

在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、 固定化時(shí)間為30 min的條件下，考察SAM合成酶加量對固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 SAM合成酶加量對SAM合成酶固定化的影響

由圖3可知，隨著SAM合成酶加量的增加，固定化酶活力逐漸上升；當(dāng)酶加量增加到75 mg時(shí)，載體承載量達(dá)到最大值，此時(shí)固定化酶活力回收率為42%；繼續(xù)增加酶加量，固定化酶活力反而下降。因此，確定SAM合成酶加量以75 mg較為適宜。

2.2.4 固定化時(shí)間的確定

在SAM合成酶加量為75 mg、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的條件下，考察固定化時(shí)間對固定化酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 固定化時(shí)間對SAM合成酶固定化的影響

由圖4可知，當(dāng)固定化時(shí)間為30 min時(shí)，固定化酶活力達(dá)到最大值；固定化時(shí)間過短或過長，均會(huì)使固定化酶活力下降。這是因?yàn)?，隨著固定化時(shí)間的延長，SAM合成酶在海藻酸鈉凝膠中被包埋得更牢固，不易脫落；但當(dāng)固定化時(shí)間過長時(shí)，海藻酸鈉凝膠球表面形成的鈣化層過于致密，影響反應(yīng)底物和產(chǎn)物的自由擴(kuò)散，導(dǎo)致固定化酶活力下降。因此，確定固定化時(shí)間以30 min較為適宜。

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶于不同溫度下保溫5 h，分別測定酶活力。以未處理的固定化酶和游離酶的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果見圖5。

圖5 固定化和游離SAM合成酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可知，在50 ℃ 下保溫5 h，游離酶活力完全喪失，而固定化酶仍保留69%的酶活力；在55 ℃下保溫5 h，固定化酶仍保留32%的酶活力?？梢姽潭ɑ傅臒岱€(wěn)定性優(yōu)于游離酶。這是由于，SAM合成酶經(jīng)固定化后，酶分子被固定在凝膠中，分子整體運(yùn)動(dòng)受限，酶的熱穩(wěn)定性也隨之增強(qiáng)。

2.3.2 固定化酶的pH值穩(wěn)定性

4 ℃下，將固定化酶和游離酶在pH值為6.0～9.5的緩沖溶液中放置10 h，測定酶活力。以未處理的固定化酶和游離酶的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果見圖6。

圖6 固定化和游離SAM合成酶的pH值穩(wěn)定性

由圖6可知，游離酶在pH值為6.5～8.5的條件下均能保留50%以上的酶活力，但在pH值為6.0的緩沖溶液中幾乎完全失活；固定化酶在pH值為7.5～9.0的條件下均能保留84%以上的酶活力，在pH值為9.0時(shí)仍保留88%的酶活力。因此，固定化酶在堿性條件下的穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。

2.3.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

取一定量固定化SAM合成酶，連續(xù)進(jìn)行8批次反應(yīng)，每次反應(yīng)完畢將固定化酶過濾洗滌后重復(fù)使用。測定每次反應(yīng)后固定化SAM合成酶的剩余酶活力。以反應(yīng)前固定化酶的總活力為100%，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果見圖7。

圖7 固定化酶的操作穩(wěn)定性

由圖7可知，在第1批次反應(yīng)后酶活力有一定程度的下降，殘余酶活力為89%；連續(xù)反應(yīng)5批次后，保留82%的酶活力；連續(xù)反應(yīng)8批次后，仍保留54%的酶活力。表明固定化SAM合成酶具有較好的操作穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

以海藻酸鈉包埋法制備固定化SAM合成酶具有工藝簡單、條件溫和及操作方便的特點(diǎn)。最佳固定化條件為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、SAM合成酶加量75 mg、固定化時(shí)間30 min，在此條件下，固定化酶活力回收率達(dá)到42%。固定化酶在50 ℃下保溫5 h仍保留69%的酶活力，而游離酶則完全失活。固定化酶在堿性條件下的穩(wěn)定性較好，在pH值為7.5～9.0的緩沖溶液中4 ℃下保溫10 h仍保留84%以上的酶活力。將固定化酶用于SAM的合成，連續(xù)反應(yīng)5批次后，仍保留82%的酶活力。該研究為工業(yè)化生產(chǎn)SAM提供了一條新途徑。

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