高 冷，楊 爽，趙先花

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130012)

東北林蛙(Ranachensinensis)亦稱(chēng)蛤士蟆，廣泛分布于我國(guó)東北地區(qū)，是集藥、食、補(bǔ)于一體的珍貴經(jīng)濟(jì)蛙種。雌性林蛙的輸卵管即蛤蟆油已載入《中國(guó)藥典》，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤(rùn)肺等功效[1]。蛤蟆油分離后的殘?jiān)泻写罅康牧滞苈?，林蛙卵中蛋白含量較為豐富，含有人體營(yíng)養(yǎng)所需的8種必需氨基酸，且富含微量元素，是一種優(yōu)質(zhì)的天然保健品原料[1,2]，可以通過(guò)水解制備混合氨基酸，但目前開(kāi)發(fā)利用甚少，往往都被廢棄掉，造成了極大浪費(fèi)。

傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法有酸法和堿法，其中酸法雖然可使林蛙卵粕蛋白水解充分，但會(huì)導(dǎo)致色氨酸全部破壞；而堿法能夠引起消旋作用，從而降低氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]；酶水解反應(yīng)條件溫和，對(duì)氨基酸破壞小，是水解林蛙卵粕蛋白最有前途的方法。堿性蛋白酶是一類(lèi)適宜在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類(lèi)[4]。作者選用堿性蛋白酶對(duì)CO2超臨界萃取蛤蟆油后的林蛙卵粕進(jìn)行水解，并優(yōu)化了水解工藝條件，擬為林蛙卵的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

林蛙卵粕，吉林吉云鹿業(yè)發(fā)展有限公司；堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其它試劑均為分析純。

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SH2601型精密酸度計(jì)，上海大普儀器有限公司；電子萬(wàn)用爐，天津泰斯特儀器有限公司；GL-21LM型離心機(jī)，星科科學(xué)儀器有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶水解流程

按4%(質(zhì)量濃度，下同)稱(chēng)取經(jīng)CO2超臨界萃取蛤蟆油后的林蛙卵粕加入到蒸餾水中→調(diào)節(jié)pH值→加入2000 U·g-1的堿性蛋白酶→60 ℃恒溫水浴水解120 min(保持pH值不變)→90 ℃水浴加熱10 min→冷卻至室溫，調(diào)pH值至中性→離心(7000 r·min-1，10 min)→測(cè)定上清液水解度。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

固定其它工藝條件，分別改變反應(yīng)溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、酶加量(1000 U·g-1、1500 U·g-1、2000 U·g-1、2500 U·g-1、3000 U·g-1)、底物濃度(3%、4%、5%、6%、7%)、反應(yīng)時(shí)間(30 min、60 min、120 min、180 min、240 min)，考察其對(duì)蛋白水解度的影響。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取反應(yīng)溫度、酶加量、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間為考察因素，以蛋白水解度為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9(43)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳水解條件。

1.3 分析與檢測(cè)[5]

采用微量凱氏定氮法并參照GB 5009.5-85測(cè)定蛋白質(zhì)(總氮)含量；采用甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮含量。依下式計(jì)算蛋白水解度(DH)：

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)水解度的影響(圖1)

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)水解度的影響

由圖1可知，隨著反應(yīng)溫度的上升，水解度逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最高；當(dāng)反應(yīng)溫度高于60 ℃后，酶逐漸變性失活，導(dǎo)致水解度降低。

2.1.2 酶加量對(duì)水解度的影響(圖2)

圖2 酶加量對(duì)水解度的影響

由圖2可知，隨著酶加量的增加，水解度逐漸升高；當(dāng)酶加量達(dá)到2000 U·g-1后，水解度升幅趨緩。

2.1.3 底物濃度對(duì)水解度的影響(圖3)

圖3 底物濃度對(duì)水解度的影響

由圖3可知，底物濃度在3%～4%之間時(shí)，酶與底物結(jié)合幾率較低，反應(yīng)速度慢，導(dǎo)致水解度較低；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，水解度達(dá)到最高；底物濃度在4%～7%之間時(shí)，底物與酶分子之間接觸的機(jī)會(huì)減少，影響反應(yīng)速度，也使得水解度降低。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響(圖4)

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖4可知，反應(yīng)前60 min內(nèi)，水解度迅速升高；反應(yīng)120 min后，水解度升幅趨緩。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表1)

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表1可知，各因素對(duì)蛋白水解度的影響大小依次為A>C>D>B，即反應(yīng)溫度的影響最大，底物濃度次之，而后是反應(yīng)時(shí)間，酶加量的影響最??；最佳水解條件為A3B2C1D2，即反應(yīng)溫度為60 ℃、酶加量為2000 U·g-1、底物濃度為4%、反應(yīng)時(shí)間為120 min，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，水解度分別為10.19%、10.16%、10.19%，平均為10.18%。

3 結(jié)論

以堿性蛋白酶水解林蛙卵粕蛋白制備混合氨基酸，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳水解條件為：反應(yīng)溫度60 ℃、酶加量2000 U·g-1、底物濃度4%、反應(yīng)時(shí)間120 min，此時(shí)蛋白水解度為10.18%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王秋雨，金莉莉，婁虹，等.蛤士蟆油和青蛙油主要營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定[J].特產(chǎn)研究，2003，25(4)：37-40.

[2] 王宇，尚德靜，馮伯森.中國(guó)林蛙蛙卵營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，27(4)：471-473.

[3] 王鏡巖,朱圣庚,徐長(zhǎng)法,等.生物化學(xué)[M].北京:高等教育出版社，2002：123-154.

[4] Rose A H.Economic Microbiology[M].London：Academic Press，1980：51-72.

[5] 李建杰，榮瑞芬.堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白水解條件的優(yōu)化研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11(2)：129-135.