高文斌 鄭真真 高 豐 韓傳軍 黃建輝 張曉晨 王武龍3 汪艾曼 王若雨 方今女

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的致死性腫瘤［1］。腦轉(zhuǎn)移是肺癌治療過(guò)程中面臨的重大難題，不僅因其多發(fā)性，還因其嚴(yán)重影響患者的生存率和生活質(zhì)量［2-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約15% ～20%的非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)在進(jìn)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移［4］。傳統(tǒng)的腦轉(zhuǎn)移治療以放射治療為主，隨著化療藥物及化療方案的不斷改進(jìn)，化療在腦轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用越來(lái)越廣。拓?fù)涮婵?topotecan，TPT)是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ類(lèi)抑制劑，能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性而使得DNA斷裂，抑制DNA的復(fù)制，殺傷腫瘤細(xì)胞［5］?；A(chǔ)研究表明TPT在血腦屏障通過(guò)率可以達(dá)到30%并對(duì)多種腫瘤具有作用［6-7］。本研究采用低劑量TPT作用于體外培養(yǎng)的耐順鉑肺腺癌細(xì)胞HTB-56/DDP，并進(jìn)行觀(guān)察，旨在探討TPT治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

人耐順鉑肺腺癌細(xì)胞HTB-56/DDP，本實(shí)驗(yàn)室保存;拓?fù)涮婵凳琴F州漢方制藥有限公司產(chǎn)品;Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit、Z-IETD-FMK、Z-DEVD-FMK為BioVision公司的產(chǎn)品;DMEM購(gòu)于Gibco公司，噻唑藍(lán)購(gòu)于sigma公司，小牛血清為四季青產(chǎn)品。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):人耐順鉑肺腺癌細(xì)胞HTB-56/DDP培養(yǎng)于青霉素105 IU/L、鏈霉素100 mg/L，37℃，5%CO2，飽和濕度條件下，含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)分裂期。

2.Caspase酶抑制劑對(duì)TPT作用實(shí)驗(yàn)分組:①對(duì)照組:空白對(duì)照;②TPT單藥組(6.4μmol/L);③TPT與Z-IETD-FMK合用組;④TPT和DEVD-FMK合用組。至研究終點(diǎn)，倒置顯微鏡下觀(guān)察形態(tài)后，應(yīng)用MTT法酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定其490 nm處吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)副孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.Annexin-V FITC及PI雙染測(cè)早期凋亡:對(duì)以上實(shí)驗(yàn)組處理8 h后，收集上述各組細(xì)胞0.25%胰酶消化，按照Annexin v-fict apoptosis detection kit說(shuō)明書(shū)操作步驟，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

4.流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期:處理細(xì)胞24 h后，收集上述各組細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，染色前離心除去乙醇，磷酸鹽緩沖液洗2次，加入RNA酶和PI復(fù)合染液，于室溫下避光染色30 min，用Elite ESP型流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，分析細(xì)胞周期的變化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Caspase酶抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)分析caspase-3抑制劑Z-IETD-FMK及caspase-8抑制劑Z-DEVD-FMK所在的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均高于單用TPT組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、Annexin-V FITC與PI雙染測(cè)早期凋亡

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)TPT處理12 h的細(xì)胞顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，流式細(xì)胞儀下出現(xiàn)早期凋亡，凋亡率與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。合用caspase-3抑制劑Z-IETD-FMK及caspase-8抑制劑Z-DEVD-FMK實(shí)驗(yàn)組早期凋亡出現(xiàn)時(shí)間延遲，并且凋亡比例1.50%、1.88%與對(duì)照組(1.27%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果如圖1～4所示。

三、流式細(xì)胞法測(cè)周期

處理24 h倒置顯微鏡下觀(guān)察部分細(xì)胞懸浮，細(xì)胞縮小形狀不規(guī)則并且臺(tái)盼藍(lán)拒染。流式分析得S期細(xì)胞減少與對(duì)照組(40.7±3.2%)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);G1期細(xì)胞比例增高(P＜0.05)，G2期細(xì)胞比例下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 未加 TPT組

圖2 TPT6.4μmol·L-1

圖3 TPT加IETD-FMK

圖4 TPT加DEVD-FMK

表1 Caspase酶抑制劑對(duì)HTB-56/DDP細(xì)胞株生存率影響的比較()Table 1 Comparison of the effect of caspase inhibitor on HTB-56/DDP cell strain survival ratios()

表1 Caspase酶抑制劑對(duì)HTB-56/DDP細(xì)胞株生存率影響的比較()Table 1 Comparison of the effect of caspase inhibitor on HTB-56/DDP cell strain survival ratios()

注:aTPT組與caspase抑制劑組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

表2 各組對(duì)HTB-56/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響()Table 2 The effect of the HTB-56/DDP cell growth cycle()

表2 各組對(duì)HTB-56/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響()Table 2 The effect of the HTB-56/DDP cell growth cycle()

注:aTPT組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

分 組 G1% S% G2 19.4 ±1.045.8 ±1.0 45.8 ±1.0 16.1 ±3.2 TPT24h 64.1 ±2.5a 27.5 ±2.4a/M%對(duì)照組

討 論

NSCLC患者因發(fā)生腦轉(zhuǎn)移導(dǎo)致生存率和生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，需采取多種針對(duì)性的治療措施。單發(fā)腦轉(zhuǎn)移可作為手術(shù)和SRS的指征，具體采用何種方式要視腫瘤的部位，全身性疾病及患者的醫(yī)療條件決定。對(duì)于多發(fā)性轉(zhuǎn)移，立體定向放射治療(stereotactic radiosurgery，SRS)或者全腦放療(whole blood recal cification time，WBRT)要單獨(dú)或聯(lián)合用于手術(shù)的輔助治療，應(yīng)視具體病例要具體分析。但是肺癌常伴發(fā)多發(fā)腦轉(zhuǎn)移及顱外轉(zhuǎn)移病灶，是治療失敗的常見(jiàn)原因。過(guò)去由于血腦屏障的顧慮化療很少應(yīng)用于腫瘤腦轉(zhuǎn)移，事實(shí)上當(dāng)腫瘤發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的時(shí)候血腦屏障已經(jīng)發(fā)生損壞，藥物部分可以通過(guò)，并且經(jīng)過(guò)放射等治療，血腦屏障破壞更嚴(yán)重。有學(xué)者指出是缺乏有效抗腫瘤藥而不是血腦屏障本身阻礙了聯(lián)合化療在腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用［8-9］。隨著化療藥物及化療方案的不斷改進(jìn)，化療在腫瘤腦轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用越來(lái)越廣，并陸續(xù)有將其應(yīng)用于一線(xiàn)方案治療腫瘤腦轉(zhuǎn)移的報(bào)道［10-11］。

TPT是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)抑制劑，可誘導(dǎo)DNA單鏈斷裂從而破壞DNA的螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而結(jié)合到拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ-DNA復(fù)合物上，從而阻止斷裂的單鏈修復(fù)，致使DNA雙鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。TPT現(xiàn)多用于化療敏感、一線(xiàn)治療失敗的小細(xì)胞肺癌和晚期卵巢癌的二線(xiàn)化療［12-13］。TPT單藥在難治性或者復(fù)發(fā)性小細(xì)胞肺癌中有效率為10% ～40%［14-17］，而在高文斌等［18］治療肺癌腦轉(zhuǎn)移臨床觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)TPT有效率為37.21%，臨床獲益率達(dá)81.4%，TPT在腦內(nèi)發(fā)揮發(fā)抗腫瘤的作用與顱外相當(dāng)。為探究其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)于體外觀(guān)察了TPT對(duì)耐順鉑肺腺癌細(xì)胞HTB-56/DDP的殺傷作用。結(jié)果顯示TPT對(duì)耐順鉑株依舊有細(xì)胞毒作用，并且由于TPT抑制TopoⅠ作用導(dǎo)致DNA鏈的斷裂及合成停止致使S期細(xì)胞被不可逆的損傷，在我們?cè)囼?yàn)中也證實(shí)S期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比明顯降低，表明TPT能特異性殺傷S期細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)停止于G1期。這不但引能起細(xì)胞死亡，而且還有放射增敏作用。

凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，近年來(lái)一系列的研究表明凋亡是抗癌作用的可能機(jī)制之一，已成為研究的熱點(diǎn)。Caspase酶活化是凋亡的關(guān)鍵性步驟［18］，Caspase全稱(chēng)為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。各種Caspase都富含半胱氨酸，它們被激活后，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進(jìn)行切割，從而造成細(xì)胞凋亡。各種凋亡信號(hào)，如fas、化療放療等均先激活啟動(dòng)性Caspase，觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，再激活效應(yīng)性Caspase作用于相應(yīng)底物。近期研究表明caspase-3是Caspase家族最重要的成員，而caspase-8則處于上游，它的活化可以啟動(dòng)下游的 caspase-3的活化［19-20］。我們的實(shí)驗(yàn)采用caspase3、8抑制劑，應(yīng)用MTT法及Annexin V-FITC染色法，發(fā)現(xiàn)TPT引起肺腺癌細(xì)胞HTB-56/DDP凋亡的機(jī)制與caspase3、8有序活化有關(guān)。caspase-3是抗腫瘤藥誘導(dǎo)凋亡的共同通路，至于TPT激活caspase-8的具體通路還需進(jìn)一步研究。

TPT骨髓反應(yīng)較重，Ⅲ～Ⅳ度的白細(xì)胞下降占57.14% ～62.26%，Ⅲ～Ⅳ度血小板下降占42.86%～52.38%［21-22］，但是TPT能透過(guò)血腦屏障，對(duì)于顱內(nèi)顱外病灶都有一定的臨床有效率，因此本研究認(rèn)為低劑量的TPT可能是逆轉(zhuǎn)耐藥或聯(lián)合應(yīng)用于有腦部轉(zhuǎn)移的晚期肺癌的一個(gè)具有潛力的藥物。

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