李冬艷 張新日 劉超峰

機械通氣在提供有效呼吸支持的同時還可導致嚴重的并發(fā)癥，即呼吸機所致肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。已有研究表明，肺表面活性蛋白A(surfactant protein-A，SP-A)在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但在VILI的發(fā)病中是否具有同樣的作用目前尚不完全清楚［1-2］。本研究通過觀察氨溴索對機械通氣大鼠肺組織SP-A表達水平的影響，探討SP-A在VILI發(fā)生過程中的作用機制，以及氨溴索對VILI的防治作用。

材料和方法

一、動物模型的制備

24只雄性健康Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，清潔級)，體質(zhì)量300～380 g，隨機分為3組:①對照組:氣管切開前5 d開始每天上午及切開前1 h經(jīng)腹腔注入生理鹽水4 ml/kg，未行機械通氣;②機械通氣組(mechanical ventilation group，MV組):通氣前5 d開始每天上午及通氣前1 h經(jīng)腹腔注入生理鹽水4 ml/kg，VT30 ml/kg;③氨溴索干預組(ambroxol pretreatment group，AMB組):通氣前5 d開始每天上午及通氣前1 h經(jīng)腹腔注入氨溴索30 mg/kg，VT30 ml/kg。采用25%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開。MV組與AMB組大鼠均與動物人工呼吸機(DH-150型，浙江大學醫(yī)學儀器廠制造)相連接行機械通氣。呼吸機參數(shù)設(shè)置為:I︰E:1︰3，F(xiàn)iO2:21%，RR:60次/min，通氣時間為120 min。

二、標本收集

通氣結(jié)束后經(jīng)腹主動脈放血處死大鼠，取左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)(4 ml×4次)，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收量不少于80%，BALF經(jīng)單層紗布過濾，靜置10 min后行瑞氏染色，光鏡下行中性粒細胞(polymorphonuctear，PMN)計數(shù);剩余BALF以3000 r/min離心10 min，取上清液－20℃凍存待測。在無菌狀態(tài)下取右肺上葉置于EP管中，－70℃冰箱保存，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。取右肺下葉用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，用于普通病理和免疫組織化學染色。

三、BALF蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)測定BALF蛋白含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

四、肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達測定

采用RT-PCR法測定肺組織SP-A mRNA表達，方法如下:用TRIzol法提取肺組織總mRNA，以大鼠GAPDH作為內(nèi)對照。大鼠SP-A及內(nèi)參引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。SP-A上游引物:5’-TAA GTG CTG CCC TCT GAC CT-3’;下游引物:5’-AGG AGC CAT ACA TGC CAA AC-3’;反應條件:94℃預變性2 min，94℃變性20 s，57℃復性30 s，72℃延伸30 s，共36個循環(huán)，擴增片段長度為246 bp。GAPDH 上游引物:5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’;下游引物:5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’;反應條件:94℃預變性 2 min，94℃變性 20 s，56℃復性 30 s，72℃延伸 30 s，共 36 個循環(huán)，擴增產(chǎn)物長度為307 bp。取PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶寬度，以目的基因光密度值與內(nèi)參照光密度值的比值表示肺組織SP-A mRNA的相對表達量。

采用免疫組織化學染色方法(SABC法)測定肺組織SP-A蛋白表達，具體操作步驟參照試劑盒說明(試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。兔抗大鼠抗體工作濃度為1︰50，以PBS(磷酸鹽緩沖液)代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷:陽性染色為細胞漿呈棕黃色。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機選取5個視野進行觀察，采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野的光密度值，以上述5個視野的平均值作為該組大鼠肺組織SP-A蛋白表達的相對含量。

五、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、大鼠肺組織病理學變化

光鏡下觀察，對照組大鼠細支氣管上皮和肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)正常，無明顯炎癥細胞浸潤;MV組肺組織可見肺泡間質(zhì)增厚，大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有出血;AMB組肺組織可見肺間質(zhì)輕度水腫，少量炎癥細胞浸潤。見圖1～3。

圖1 對照組大鼠肺組織(HE×400)

圖2 MV組大鼠肺組織大量炎癥 細胞浸潤，肺泡間隔增厚，紅細胞滲入肺泡腔(HE×400)

圖3 AMB組大鼠肺組織少量炎癥 細胞浸潤，輕度肺間質(zhì)水腫(HE×400)

二、BALF PMN計數(shù)及蛋白含量測定結(jié)果

各實驗組大鼠BALF PMN計數(shù)和蛋白含量測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示:MV組大鼠BALF PMN計數(shù)和蛋白含量均明顯高于對照組和AMB組(P＜0.01);AMB組大鼠BALF PMN計數(shù)和蛋白含量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各實驗組大鼠BALF PMN計數(shù)及蛋白含量測定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

表1 各實驗組大鼠BALF PMN計數(shù)及蛋白含量測定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

注:a與對照組比較:P＜0.01;b與MV組比較:P＜0.01

三、肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平測定結(jié)果

各實驗組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平測定結(jié)果見表2和圖4～7。結(jié)果顯示，MV組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平均明顯低于對照組和AMB組(P值均＜0.01);AMB組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 各實驗組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

表2 各實驗組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

注:a與對照組比較:P＜0.01;b與MV組比較:P＜0.01

組 別 例數(shù) SP-A mRNA表達 SP-A 1.55 ± 0.14 0.33 ±0.02 MV 組 8 0.73 ± 0.77a 0.26 ±0.11a AMB 組 8 1.43 ±0.23b 0.31 ±0.01蛋白表達對照組8 b

圖4 對照組大鼠細支氣管上皮細胞SP-A蛋白表達(SABC×400)

圖5 MV組大鼠細支氣管上皮細胞SP-A蛋白表達(SABC×400)

圖6 AMB組大鼠細支氣管上皮細胞SP-A蛋白表達(SABC×400)

圖7 各組大鼠肺組織SP-A mRNA表達水平(RT-PCR法)注:M:Marker 1:對照組;2:機械通氣組;3:AMB干預組

討 論

肺泡表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)是一種由糖類、脂類及蛋白質(zhì)組成的混合物，具有多種生理功能及生物學效應。PS主要成分之一是肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)，約占肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)總量的50%，主要由Ⅱ型肺泡上皮細胞和細支氣管非纖毛柱狀上皮細胞分泌，對維持肺泡正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用［3-4］。研究表明，SP-A質(zhì)和量的異常與許多肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、ALI、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARPS)、肺纖維化等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但SP-A在VILI的發(fā)病中是否具有同樣的作用目前尚無定論。

本實驗結(jié)果表明，大潮氣量通氣組大鼠肺間質(zhì)明顯水腫，部分肺泡破裂融合，肺組織內(nèi)大量PMN浸潤，BALF中蛋白含量明顯升高，而肺內(nèi)SP-A表達水平明顯降低。其機制可能是:①大潮氣量機械通氣直接損傷Ⅱ型肺泡上皮細胞，使SP-A合成和分泌減少;②肺內(nèi)PMN活化后釋放的彈性蛋白酶不但可使Ⅱ型肺泡上皮細胞變性、壞死，還可直接降解SP-A，導致其含量下降［5］;③炎癥因子如TNF-α等通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，使細胞內(nèi)SP-A mRNA及其蛋白表達減少［6］;④過氧化物一方面通過阻止轉(zhuǎn)錄因子TTF1與SP-A調(diào)控區(qū)的DNA結(jié)合，使SP-A合成減少，另一方面又可與SP-A發(fā)生交聯(lián)反應，使其蛋白構(gòu)型發(fā)生改變，活性降低［7］。

研究顯示，SP-A不但具有降低肺泡表面張力和維持肺內(nèi)自身免疫的作用，還能對抗和清除炎癥因子、過氧化物和蛋白水解酶，對肺組織具有一定保護作用，故SP-A質(zhì)、量及功能的改變可加劇肺內(nèi)炎癥反應，從而形成惡性循環(huán)。因此，通過減少SP-A破壞，上調(diào)SP-A的表達，促進PS的合成，對VILI的防治應具有重要意義。

氨溴索是具有多種生物學效應的化痰劑。近年來研究表明，大劑量氨溴索對急性肺損傷有一定的保護作用［8-9］。其機制有三方面:①促進肺泡表面活性物質(zhì)生成，降低肺泡表面張力;②減少過氧化物生成，減輕肺部氧化性損傷;③抑制炎癥細胞在肺內(nèi)聚集、活化和釋放炎癥因子，減輕過度炎癥反應對肺組織的破壞作用。本實驗結(jié)果顯示，AMB組大鼠SP-A mRNA及蛋白表達水平明顯高于MV組，說明大劑量氨溴索可通過直接或間接途徑減少SP-A的破壞，促進SP-A表達從而減輕肺組織損傷，對VILI的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護作用。

總之，SP-A是VILI的發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素之一，氨溴索可通過減少SP-A的破壞，促進SP-A表達而減輕呼吸機所致肺組織損傷，對VILI的防治有積極作用。

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8 蔡洪流，朱 紅，李立斌，等.大劑量鹽酸氨溴索對大鼠內(nèi)毒素性肺損傷保護作用的實驗研究［J］.中國急救醫(yī)學，2006，26(8):605-607.

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