欽富華，林杭娟，高建青

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058）

熊果酸又名烏索酸，是廣泛存在于植物中的五環(huán)三萜類化合物。研究表明熊果酸具有抗肝炎、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)?、降低血糖等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，且毒性低，不良反應(yīng)小，具有廣泛的開發(fā)前景［1-2］。熊果酸在水中的溶解度極小，溶出速度很慢，生物利用度低。已有文獻(xiàn)報(bào)道將熊果酸制成固體分散體、包合物、滴丸及納米粒等［3-6］，以期提高其溶出及口服生物利用度。

自微乳化給藥體系 (self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)是由油相、表面活性劑及助表面活性劑組成的均一、透明的溶液，一旦與水相混合，在環(huán)境溫度(通常指體溫37℃)下只需要溫和攪拌就能自發(fā)形成透明或者半透明的微乳。微乳可增加藥物的溶解度和吸收面積，處方中含有表面活性劑，可提高藥物的溶出，增加小腸上皮的滲透性，有助于提高藥物的生物利用度［7-8］。自微乳化給藥體系制備簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，將溶液分裝于軟膠囊中，劑量準(zhǔn)確且服用方便，是提高難溶性藥物口服吸收的良好載體。本研究制備了熊果酸自微乳制劑，并對(duì)其體外性質(zhì)進(jìn)行了考察。

1 材料與儀器

1.1 材料 熊果酸對(duì)照品 (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)YY20100425)；熊果酸原料藥 (西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，純度＞98%)；Labrafil M 1944CS、Labrasol、Transcutol P(法國佳法賽公司)；Cremophor EL(德國巴斯夫公司)；甲醇、乙腈為色譜純，其他藥品、試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀 (美國戴安公司)；Nanosize-90粒徑測定儀 (馬爾文儀器有限公司)；TU-1810SPC型紫外分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限公司)；SHA-B型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 (上海金鵬分析儀器有限公司)；SB25-120超聲波清洗機(jī) (寧波新芝生物科技股份有限公司)；METTLER TOLEDO電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 熊果酸HPLC方法的建立［9］色譜條件 Agilent TCC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.3%磷酸 (85∶15)；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，熊果酸色譜峰理論塔板數(shù)大于3000，輔料不干擾熊果酸的測定。熊果酸質(zhì)量濃度在2.5～120 mg/L的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，A=0.0852ρ+0.0033，r=0.9999，高、中、低質(zhì)量濃度的平均回收率為101.3%、101.7%和101.9%，RSD為0.15%、1.11%和1.59%。日內(nèi)和日間精密度 (RSD)均小于2.0%，符合含量測定要求。

2.2 熊果酸自微乳的處方篩選

2.2.1 熊果酸在油相、乳化劑和助乳化劑中溶解度考察

本研究選擇了植物油、油酸乙酯等不同的油相，吐溫、Cremophor EL等HLB值較高的乳化劑及乙醇、PEG400等助乳化劑，進(jìn)行了熊果酸的溶解度考察。各取約2 g的油相、乳化劑及助乳化劑，加入過量的熊果酸，渦旋分散均勻，25℃水浴平衡48 h，10000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，續(xù)濾液用甲醇稀釋適宜倍數(shù)后用HPLC測定。平衡溶解度結(jié)果顯示熊果酸在油相中溶解不理想，在油酸乙酯和Labrafil M 1944 CS中相對(duì)較好，分別為 (1.41±0.07)mg/g和 (2.35±0.26)mg/g；在乳化劑和助乳化劑中，特別是Cremophor EL和Transcutol P中溶解較好，分別為 (10.80±1.58)mg/g和 (10.76±1.21)mg/g。

2.2.2 油和乳化劑的配伍 將油相與乳化劑按2∶3(w/w)的比例在37℃的水浴中振蕩混合后觀察其分散情況，再加入100倍量的蒸餾水，輕微振蕩，觀察其乳化情況。根據(jù)文獻(xiàn)將自微乳化情況分為5個(gè)級(jí)別:(A)溶液呈澄清或微泛藍(lán)色；(B)略濁，呈藍(lán)白色；(C)呈亮白色不透明液體；(D)色澤暗，呈灰白色，略帶油狀；(E)難乳化，一直有油滴存在。結(jié)果見表1。配伍實(shí)驗(yàn)表明以Cremophor EL為乳化劑的乳化效果最為理想，外觀呈現(xiàn)透明帶藍(lán)色乳光，因此確定乳化劑為Cremophor EL。以辛癸酸甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯為油相的效果相差不大，但結(jié)合考慮藥物的溶解能力，最終確定油酸乙酯為油相。

表1 不同油相和乳化劑的的配伍情況

2.2.3 助乳化劑的選擇 采用滴定法繪制偽三元相圖，固定油相為油酸乙酯、表面活性劑為Cremophor EL，考察不同助表面活性劑無水乙醇、1，2—丙二醇、PEG400和Transcutol P形成微乳的能力，將表面活性劑和助表面活性劑按質(zhì)量比 (Km)1∶1混勻，再與油相以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例混勻。37℃水浴磁力攪拌條件下，滴加水相至形成澄清透明溶液，記錄微乳形成時(shí)各組分的量，Origin軟件繪制偽三元相圖。以相圖中微乳存在區(qū)域的大小來篩選助乳化劑，結(jié)果見圖1。從相圖中可知，以PEG400為助乳化劑時(shí)所形成的微乳區(qū)域最大，但是由于PEG400和Cremophor EL的互不相溶性，自乳化濃縮液不澄明，體系不穩(wěn)定。以Transcutol P、乙醇和1，2—丙二醇為助乳化劑時(shí)效果相似，但Transcutol P略好，同時(shí)藥物在Transcutol P中的溶解度較大，故選擇Transcutol P為助乳化劑。

圖1 含不同助乳化劑的相圖

2.2.4 處方優(yōu)化 對(duì)EO/Cremophor EL/Transcutol P進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，考察不同Km對(duì)自微乳化區(qū)域的影響，以粒徑大小和分布情況、體系載藥量大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定體系的組成為油相為油酸乙酯 (15.0%)，表面活性劑為Cremophor EL(40.0%)，助表面活性劑為 Transcutol P(45%)，熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg/g。

2.3 微乳形態(tài)和粒徑分布 取熊果酸SMEDDS，加蒸餾水稀釋50倍，待自乳化完全后，取適量滴在銅網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸 (pH4.47)負(fù)染色，晾干后電鏡觀察 (見圖2)，并用粒徑測定儀測定微乳的粒徑和電位 (見圖3)。熊果酸SMEDDS用蒸餾水稀釋50倍后形成的微乳在電鏡下觀察，乳滴呈圓球形，形態(tài)良好。粒徑分析儀測定微乳的平均粒徑為23.18 nm，多分散指數(shù)PDI為0.146，粒徑分布集中。微乳的zeta電位為－5.35 mv。

圖2 熊果酸微乳透射電鏡照片 (×29000)

圖3 熊果酸微乳粒徑分布圖

2.4 體外溶出 取自制熊果酸自微乳膠囊 (含熊果酸5 mg)和熊果酸膠囊 (含熊果酸10 mg)，按照《中國藥典》2010年版附錄溶出度測定法 (轉(zhuǎn)籃法)測定，以0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液500 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度37℃。依法操作，分別于5、10、20、30、45、60 min取樣5 mL，立即補(bǔ)充5 mL介質(zhì)。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，取續(xù)濾液，加甲醇稀釋后HPLC法測定，外標(biāo)法計(jì)算溶出介質(zhì)中熊果酸含有量，計(jì)算累積溶出百分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖4。體外溶出結(jié)果表明，熊果酸SMEDDS在10 min內(nèi)溶出達(dá)80%以上，而膠囊60 min溶出僅20%左右。SMEDDS可大大提高熊果酸的體外溶出。

圖4 熊果酸SMEDDS與熊果酸膠囊的體外溶出比較

3 討論

3.1 溶解度測定的過程中，表面活性劑、助表面活性劑和多數(shù)油相均能溶于甲醇，但是植物油、色拉油、橄欖油等不能完全溶于甲醇，故本實(shí)驗(yàn)采用了甲醇提取的方法，將少量植物油與甲醇渦旋混合、離心取上清液后測定。

3.2 根據(jù)Pouton［10］提出的脂質(zhì)制劑的分類方法，可以將自微乳化制劑歸納為兩類，一類是油相比例較高且不含助乳化劑，一類是油相比例較低并含有助乳化劑。由于熊果酸在油相中的溶解度不是很理想，而在助乳化劑中溶解度較好，因此本研究選擇含助乳化劑的體系。助乳化劑的作用一方面協(xié)助降低油水界面張力促使微乳易于形成；另一方面也是很重要的助溶劑，能提高微乳的載藥量。

3.3 在處方優(yōu)化的過程中，本研究考察了Km對(duì)微乳區(qū)域形成的影響，Km增加，微乳形成的區(qū)域變大，但是相應(yīng)的體系的黏度也增大，自微乳化的時(shí)間延長。Km值減小，乳滴的粒徑變大，且會(huì)出現(xiàn)藥物析出的現(xiàn)象，可能是助乳化劑中藥物被大量稀釋后出現(xiàn)“擱淺”現(xiàn)象。

3.4 中藥中提取得到的大多數(shù)活性成分水溶性均較差，其體外溶出和口服生物利用度較低。自微乳制劑能明顯地提高藥物的溶出并增加吸收，是難溶性中藥的有效載體。自微乳制劑已被證明能增加熊果酸的體內(nèi)吸收。歐曉霞等［11］以油酸為油相、吐溫20和乳化劑OP為乳化劑、異丙醇為助乳化劑制備了熊果酸的自微乳制劑，并以緩釋片和混懸液為對(duì)照，進(jìn)行了大鼠體內(nèi)生物利用度的研究，結(jié)果表明自微乳制劑的相對(duì)生物利用度為326.5%。本制劑的體內(nèi)吸收情況有待于研究。

［1］夏國豪.熊果酸抗腫瘤作用研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊，2002，29(6):420-422.

［2］孟艷秋，陳 瑜，王 趲，等.熊果酸的研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2007，16(1):25-28.

［3］賴 玲，楊 光，楊 昕.熊果酸固體分散體的制備與體外溶出度測定［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24(6):517-518.

［4］權(quán) 鵬，李 瑞，劉東飛.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與灰色關(guān)聯(lián)度分析用于熊果酸包合物載藥量的影響因素研究［J］.中國藥房，2008，19(13):973-974.

［5］鄒盛勤，陳 武，伍曉春.熊果酸滴丸的制備工藝優(yōu)化［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(2):103-105.

［6］Yang L，Sun Z，Zu YG，et al.Physicochemical properties and oral bioavailability of ursolic acid nanoparticles using supercritical anti-solvent(SAS)process［J］.Food Chem，2012，132(1):319-325.

［7］陳?？?，吳丹旎，馮軼杉，等.辛伐他汀自微乳化釋藥系統(tǒng)在Beagle犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2008，17(3):166-169.

［8］馬俐麗，朱照靜.普羅布考自微乳化釋藥系統(tǒng)大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(8):1232-1234.

［9］劉 煒，吳義忠.健胃消食片中熊果酸的含量測定［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(1):5-6.

［10］Pouton C W.Lipid formulation for oral administration of drugs:nonemulsifying，self-emulsifying and ‘self-microemulsifying’drug delivery systems［J］.Eur J Pharma Sci，2000，11(Suppl):93-98.

［11］歐曉霞，汪征明，封 亮.熊果酸自微乳的制備及其生物利用度［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(1):36-39.