孫 彤，陳凱紅，裴 豪，胡敏濤

無錫市第五人民醫(yī)院1.傳染科;2.檢驗(yàn)科，江蘇 無錫214005

肝硬化是一種對(duì)人體健康威脅極大的慢性肝病，是慢性肝病發(fā)展的終末期結(jié)果，以肝組織彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成為主要特征，免疫機(jī)制多出現(xiàn)不同程度的異常，治療非常困難，預(yù)后差。國(guó)內(nèi)肝硬化的病因以乙型病毒性肝炎后肝硬化為主，中西醫(yī)結(jié)合治療因可以同時(shí)達(dá)到抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、保肝等效果，目前已經(jīng)成為肝硬化治療眾多方案中的一種有效途徑，我們研究了康艾注射液對(duì)代償期乙型肝炎后肝硬化患者治療前、后血清Th1/Th2細(xì)胞及Th1細(xì)胞因子干擾素γ(IFN-γ)和Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(IL-10)的影響，以觀察康艾注射液對(duì)患者免疫及病情的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年3月－2011年10月在我科住院的代償期乙型肝炎肝硬化活動(dòng)期患者60例，隨機(jī)分成2組，治療組男22例，女8例，年齡32～63歲，平均(45.10±7.81)歲。對(duì)照組男21例，女9例，年齡30～62歲，平均(44.87±7.72)歲。診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)的標(biāo)準(zhǔn)［1］。另選健康人群20例，為2007年5月－2011年10月于本院體檢科體檢的健康人群，男15例，女5例，年齡27～61歲，平均(44.90 ±9.54)歲。

1.2 治療方法 所有患者均接受拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司)聯(lián)合阿德福韋酯(連云港正大天晴藥業(yè)有限公司)和甘草酸制劑、還原型谷胱甘肽等治療。治療組在此基礎(chǔ)上再加用康艾注射液(長(zhǎng)白山制藥股份有限公司)40 mL加入10%葡萄糖注射液250 mL中靜脈滴注，1次/d，治療2周。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離 采集靜脈血5 mL，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma公司)分離，獲得單個(gè)核細(xì)胞，無菌玻璃培養(yǎng)皿37℃培養(yǎng)30 min，去除黏附于玻璃培養(yǎng)皿的PBMC，以獲取懸浮的淋巴細(xì)胞。加入紅細(xì)胞裂解液(美國(guó)Pharmingen公司)溶解細(xì)胞，使用T細(xì)胞分離富聚柱(hCD3+T Cell Enrichment Column，美國(guó)BD公司)，采用負(fù)篩選法獲得純化的T淋巴細(xì)胞，用含20%小牛血清(美國(guó)Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司)調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL。采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性均 ＞97%，使用BECKMAN EPICS XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER有限公司)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞純度＞98%。

1.4 Th1和Th2細(xì)胞亞群的測(cè)定 取2支試管，各加入100 μL PBMC懸液，分別加入熒光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗 CD3單抗(抗CD3-FITC)、CY5熒光染色標(biāo)記的抗CD4單抗(抗CD4-Cy5)、藻紅蛋白(phycocrthrin，PE)標(biāo)記的抗CD30單抗(抗 CD30-PE)(CD4+管);鼠抗人 IgG1-Cy5、鼠抗人 IgG1-PE、鼠抗人 IgG1-FITC(陰性對(duì)照管)，各種標(biāo)記抗體均為15 μL。混勻，4℃避光30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，各管加入0.5 mL緩沖液，上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN COULTER有限公司BECKMAN EPICS XL型流式細(xì)胞儀)檢測(cè)。分別以CD4+CD3O－T和CD4+CD3O+T細(xì)胞代表Th1和Th2細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞因子的檢測(cè) 采集外周靜脈血4 mL，分離血清并分裝，－70℃冰箱保存?zhèn)錂z。細(xì)胞因子采用雙抗體夾心ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)，IFN-γ和IL-10檢測(cè)試劑購(gòu)自晶美生物工程有限公司。用奧地利TECAN公司的spectra型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀讀取450 nm A值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IFN-γ和IL-10濃度(pg/mL)，具體步驟按說明書嚴(yán)格操作。

1.6 肝炎病毒標(biāo)記物的檢測(cè) 采用時(shí)間分辨熒光定量分析法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物(上海科華生物工程股份有限公司)，采用TAG-MAN熒光定量PCR法(Polymerase Chain Reaction)檢測(cè)HBV DNA定量(上?？迫A生物工程股份有限公司)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0軟件處理，計(jì)量資料用±s表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血清Th1、Th2細(xì)胞的變化 兩組在治療前及治療后Th1、Th2細(xì)胞的數(shù)據(jù)對(duì)比均無明顯差異，兩組Th1/Th2比值在治療前比較亦無明顯差異。治療后兩組Th1、Th2細(xì)胞均較治療前下降，治療前后比較均有明顯差異(P＜0.01)，兩組Th1/Th2比值治療后均較治療前上升，治療后康艾治療組比值明顯高于普通治療組(P＜0.01，見表1)。

兩組治療前及治療后血清Th1、Th2細(xì)胞均高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，治療后的數(shù)據(jù)更接近于健康對(duì)照組。兩組Th1/Th2比值均明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)，仍以治療后的比值更接近于健康對(duì)照組(見表1)。

2.2 兩組治療前后血清IFN-γ、IL-10的變化 兩組患者IFN-γ、IL-10的水平治療前對(duì)比差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且均明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。兩組患者IL-10水平治療后均下降，兩組治療前后對(duì)比均有明顯差異(P＜0.01)，組間對(duì)比治療后康艾治療組水平低于普通治療組(P＜0.05)。兩組患者IFN-γ水平均治療后迅速上升，兩組治療前后對(duì)比均有明顯差異(P＜0.01)，康艾治療組治療后水平明顯高于普通治療組(P＜0.01，見表2)。

表1 治療前后血清Th1、Th2細(xì)胞的變化(±s)Tab 1 The changes of Th1/Th2 before and after treatment(±s)

表1 治療前后血清Th1、Th2細(xì)胞的變化(±s)Tab 1 The changes of Th1/Th2 before and after treatment(±s)

與本組治療前比較，①P＜0.01;與康艾治療組治療后比較，②P＜0.01;與健康對(duì)照組比較，③P＜0.01

組別 例數(shù) Th1(%)Th2(%)Th1/Th2康艾治療組30治療前 30.165 ±7.522③ 3.892 ±0.791③ 7.687 ±0.425③治療后 28.941 ±8.673①③ 3.464 ±0.802①③ 8.231 ±0.604①③對(duì)照組 30治療前 30.181 ±7.791③ 3.877 ±0.792③ 7.709 ±0.495③治療后 27.596 ±7.190①③ 3.478 ±0.796①③ 7.878 ±0.343①②③健康對(duì)照組20 19.259 ±3.824 2.054 ±0.420 9.391 ±0.185

表2 治療前后血清TNFα、IFNγ的變化(±s，pg/mL)Tab 2 Changes of TNF-α，IFN-γ before and after treatment(x－ ± s，pg/mL)

表2 治療前后血清TNFα、IFNγ的變化(±s，pg/mL)Tab 2 Changes of TNF-α，IFN-γ before and after treatment(x－ ± s，pg/mL)

與本組治療前比較，①P＜0.01;與康艾治療組治療后比較，②P＜0.05;與健康對(duì)照組比較，③P＜0.01

組別例數(shù) IL-10 IFNγ康艾治療組20 18.303 ±6.708 41.705 ±14.911 30治療前 42.089±10.727③ 60.010±12.468③治療后 30.258 ±8.811①③ 88.905 ±11.407①③對(duì)照組 30治療前 43.119±15.446③ 60.469±12.720③治療后 36.161 ±9.512①②③ 77.400 ±13.901①②③健康對(duì)照組

3 討論

康艾注射液是由人參、黃芪、苦參經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)工藝提取有效成分精制而成的新型中藥復(fù)方制劑，具有扶正固本、補(bǔ)中益氣、解毒散結(jié)之功效。人參提取物含有多種皂苷及人參多糖。研究證實(shí)，人參皂苷能增強(qiáng)T細(xì)胞及B細(xì)胞功能，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2(IL-2)、干擾素產(chǎn)生及增強(qiáng)LAK細(xì)胞及NK細(xì)胞活性［2］。黃芪在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，為補(bǔ)藥之長(zhǎng)，具有“益氣補(bǔ)虛、扶正固本”之功效。黃芪含有多種氨基酸、微量元素(硒、錳、鋅、鍺)、總黃酮、黃芪多糖及黃芪總甙等多種有效成分［3］，黃芪多糖能提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、白細(xì)胞介素2(IL-2)活性［4］?？鄥⑺靥崛∥锏闹饕煞譃檠趸鄥A，氧化苦參堿能穩(wěn)定細(xì)胞膜、激活細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶，誘導(dǎo)肝細(xì)胞微粒體藥物代謝酶以及清除自由基等作用［5］，可明顯糾正肝內(nèi)Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)及Th2細(xì)胞因子(IL-10)的異常表達(dá)［6］。

人類CD4+T淋巴細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同主要分為Th1、Th2兩個(gè)亞群。Th1細(xì)胞特異分泌IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子 β(TNF-β)等 Th1 類細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，能增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-10等Th2類細(xì)胞因子，主要輔助B細(xì)胞分化成為抗體產(chǎn)生細(xì)胞，抑制細(xì)胞免疫，增強(qiáng)體液免疫，主要與HBV感染的慢性化有關(guān)［7］。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2等可抑制Th2細(xì)胞的增殖分化，并促進(jìn)Th1細(xì)胞的自身分化成熟。反之，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-10等則抑制Th1細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)Th2細(xì)胞的自身分化。在正常情況下，Th1/Th2二者處于平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常免疫功能。Th1/Th2平衡的變化會(huì)影響感染的結(jié)局［8］，慢性乙型肝炎的重要發(fā)生機(jī)制之一，表現(xiàn)為 Th1型免疫低下而 Th2型免疫亢進(jìn)［9］。Th1型免疫低下可導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子進(jìn)一步抑制Th1型免疫應(yīng)答，免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生足量的Th1型細(xì)胞因子殺傷、破壞病毒感染的靶細(xì)胞和抑制病毒基因的復(fù)制及表達(dá)，使機(jī)體不能及時(shí)清除病毒，病毒抗原的持續(xù)刺激又誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞凋亡或無功能，形成宿主對(duì)病毒抗原的免疫耐受，最終導(dǎo)致HBV的慢性持續(xù)感染［10］。反之，Th1/Th2比值增高，可促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，有利于病毒清除和疾病的恢復(fù)［8］。

IFN-γ主要是由Th1類細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是與肝炎癥程度相關(guān)性最好的細(xì)胞因子［11］，可以抑制病毒復(fù)制，直接增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷病毒感染細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的病毒感染細(xì)胞的殺傷［12-13］。IL-10屬于 Th2細(xì)胞因子，是炎癥過程的一種負(fù)性調(diào)控因子，內(nèi)源性IL-10能減少肝細(xì)胞的炎性反應(yīng)及減少中性粒細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞黏附，降低局部炎癥因子活性，限制其對(duì)肝臟的毒性，減輕肝臟損害，IL-10還可通過調(diào)節(jié)黏附因子的表達(dá)，主要是通過降低它們的含量而間接保護(hù)肝臟［14］。

本文觀察顯示，兩組患者治療前后的血清Th1、Th2水平均明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，而Th1/Th2比值又均低于健康對(duì)照組(P＜0.01)，提示肝硬化患者存在明顯的Th1、Th2平衡紊亂，Th1、Th2反應(yīng)均有增強(qiáng)，Th2反應(yīng)相對(duì)優(yōu)勢(shì)于Th1反應(yīng)，臨床上表現(xiàn)為病情遷延不愈。兩組治療后Th1、Th2水平均較治療前有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降(P＜0.01)，治療后兩組Th1/Th2比值亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上升(P＜0.01)，但兩組患者Th1/Th2比值仍均低于健康對(duì)照組(P＜0.01);兩組Th1、Th2的數(shù)據(jù)對(duì)比在治療前及治療后均無明顯差異(P＞0.05)，但在Th1/Th2比值上，兩組雖在治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療后比較則康艾治療組明顯高于普通治療組(P＜0.01)，以康艾治療組的Th1/Th2比值更接近于健康對(duì)照組。表現(xiàn)在Th1相關(guān)性細(xì)胞因子IFN-γ和Th2相關(guān)性細(xì)胞因子IL-10上，兩組患者均明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，兩組治療后IL-10較治療前有明顯下降(P＜0.01)，IFN-γ 則較治療前有明顯上升(P ＜0.01)。治療后康艾治療組IFN-γ明顯高于普通治療組(P＜0.01)，而普通治療組IL-10則高于康艾治療組(P＜0.05)，兩組患者治療后Th1應(yīng)答均增強(qiáng)，以康艾治療組更加明顯，同時(shí)兩組患者治療后Th2應(yīng)答均呈減弱傾向，治療后普通治療組的Th2應(yīng)答強(qiáng)于康艾治療組。因Th1應(yīng)答優(yōu)于普通治療組，Th2應(yīng)答弱于普通治療組，其Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生更多，增強(qiáng)了細(xì)胞免疫和CD8+T細(xì)胞活化，有利于清除病毒及促進(jìn)病情盡早恢復(fù)及阻止其病情的繼續(xù)加重，此結(jié)果與潘宇［15］的研究相符。

本組研究發(fā)現(xiàn)，代償期肝硬化患者疾病發(fā)作期均存在明顯的細(xì)胞免疫功能紊亂，Th1/Th2平衡向Th2優(yōu)勢(shì)漂移，經(jīng)相應(yīng)治療后均可向Th1優(yōu)勢(shì)漂移，而在治療過程中使用康艾注射液，可以促進(jìn)Th1應(yīng)答優(yōu)勢(shì)改變，改善代償期肝硬化患者Th1/Th2亞群的平衡，從而促進(jìn)炎癥消退及阻止病情進(jìn)一步加重，促進(jìn)病情的早日康復(fù)，同時(shí)在應(yīng)用康艾注射液過程中未發(fā)現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)。但同時(shí)本研究?jī)H屬于初步研究，需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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