夏永欣，張金平

1.南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科二病區(qū)，河南南陽473009;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

在世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率位于腫瘤發(fā)病率第5位，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占第3位［1-3］。HCC死亡率已占我國惡性肝病死因的第2位，在農(nóng)村中則為第1位。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細(xì)胞中的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長約21～22個核苷酸，可通過與靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)或5'UTRs近乎完全互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補(bǔ)結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［4-5］。

我們新近研究發(fā)現(xiàn)惡性程度較低的Hep3B細(xì)胞與侵襲力更強(qiáng)的HepG2細(xì)胞相比較:miRNA181a表達(dá)明顯上調(diào)。本研究檢測肝細(xì)胞癌、癌旁組織和正常肝組織中miRNA181a的表達(dá)水平，探索分析miRNA181a表達(dá)異常與肝細(xì)胞癌病理學(xué)特征如腫瘤大小、腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并肝硬化、血AFP濃度等的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集南陽市中心醫(yī)院及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科2010年5月－2011年5月手術(shù)切除HCC標(biāo)本30例，癌旁組織取自距離癌組織2 cm的肝臟組織，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。其中男22例、女8例，平均年齡(50±10.60)歲。術(shù)中、術(shù)前均未經(jīng)放、化療及免疫治療。另取來源于肝血管瘤患者的正常肝組織10例作為對照。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測:按照TRIzol?試劑(Invitrogen life technologies)說明書的步驟，逐步提取出組織標(biāo)本中的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值計(jì)算其濃度，并計(jì)算A260/A280值檢測其純度。

1.2.2 實(shí)時定量PCR檢測目的miRNA表達(dá)量:取2 μg總RNA作為初始模板，總反應(yīng)體系為20 μL，應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為:37℃，60 min;95℃，5 min。然后取1 μL上述cDNA為模板，以U6 SnRNA作為內(nèi)參照，每個檢測樣本做3個復(fù)孔，在Rotor-Gene 3000 Real-time PCR儀(Corbett Research)上進(jìn)行實(shí)時定量PCR，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)熱15 min;95℃，10 s;58℃，30 s;72℃，30 s，35個循環(huán);實(shí)驗(yàn)中所用引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用內(nèi)參基因U6 SnRNA標(biāo)化、計(jì)算每一種被檢miRNAs的△Ct值。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織中miR-181a基因表達(dá)量的比較與癌旁組織相比，30例HCC組織中有13例miR-181a基因表達(dá)上調(diào)，占43.33%(13/30)，17例表達(dá)下調(diào)，占56.67%(17/30)，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常肝臟組織相比，30例HCC組織中有23例miR-181a基因表達(dá)下調(diào)，占76.67%(23/30);7例表達(dá)上調(diào)，占23.33%(7/30)。miR-181a基因在HCC組織中的表達(dá)量低于正常肝組織(P＜0.01)。肝癌組織中miR-181a與癌旁組織相比無顯著性差異(P＞0.05);與正常組織相比具有顯著性差異(P＜0.01，見圖1)。

圖1 miR-181a相對表達(dá)量 HCC:肝癌組織;NT:癌旁組織;NL:正常肝組織Fig 1 The relative expression of miR-181a in different liver tissues

2.2 miR-181a基因表達(dá)相對倍數(shù)與腫瘤病理學(xué)特征的關(guān)系 miR-181a表達(dá)下調(diào)與臨床分期、HCC分化程度和合并肝硬化明顯相關(guān)(P＜0.05)。而miR-181a基因表達(dá)上調(diào)與肝細(xì)胞癌的大小、血AFP濃度、是否并發(fā)HBV感染均無明顯相關(guān)性(P＞0.05，見表1)。

3 討論

表1 miR-181a基因表達(dá)相對倍數(shù)與腫瘤病理學(xué)特征的關(guān)系Tab 1 The relationship of the miR-181a expression and pathological characteristics of HCC

研究表明，在多種腫瘤中存在miRNA的異常表達(dá);此外亦發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因中有許多作用于腫瘤相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示miRNA與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［6-7］。目前研究已表明miRNA參與了HCC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程［8-11］。許多基礎(chǔ)和臨床研究認(rèn)為miRNAs可能是一組新的致癌基因或抑癌基因。miRNAs既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性;也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a能在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)骨橋蛋白依賴的肝癌轉(zhuǎn)移［12］。Frueht等［13］用弗斯可林(forskolin)處理內(nèi)耳細(xì)胞，檢測基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR-181a表達(dá)變化，功能實(shí)驗(yàn)顯示miR-181a能促進(jìn)聽毛細(xì)胞的增殖。最近的研究顯示miR-181a能與凋亡相關(guān)的mRNA Bim靶相結(jié)合，抑制套細(xì)胞淋巴瘤或非Hodgkin淋巴瘤細(xì)胞的化療相關(guān)的凋亡，從而抑制淋巴瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性［14］。本研究從臨床標(biāo)本水平，研究miR-181a在肝癌組織中的表達(dá)量與腫瘤病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織及正常組織相比，miR-181a表達(dá)顯著下調(diào)。我們研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌miR-181a表達(dá)量與腫瘤分化程度、臨床分期和合并肝硬化明顯相關(guān)。究其詳細(xì)機(jī)制尚不十分清楚。推測可能由于miR-181a作用于轉(zhuǎn)錄因子EZF家族，進(jìn)一步促使癌細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞分化。目前還沒有miR-181a表達(dá)與肝細(xì)胞癌腫瘤病理學(xué)特征的關(guān)系方面的研究報道。miR-181a的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

［1］ El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］.Gastroenterology，2007，132(7):2557-2576.

［2］ Padma S，Martinie JB，Iannitti DA.Liver tumor ablation:percutaneous and open approaches［J］.J Surg Oncol，2009，100(8):619-634.

［3］ Cha CH，Saif MW，Yamane BH，et al.Hepatocellular carcinoma:current management［J］.Curr Probl Surg，2010，47(1):10-67.

［4］ Pillai RS.MicroRNA function:multiple mechanisms for a tiny RNA?［J］.RNA，2005，11(12):1753-1761.

［5］ Miranda KC，Huynh T，Tay Y，et al.A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes［J］.Cell，2006，126(6):1203-1217.

［6］ Schmittgen TD.Regulation of microRNA processing in development，differentiation and cance［J］.J Cell Mol Med，2008，12(5B):1811-1819.

［7］ Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cance［J］.Cell Cycle，2008，7(17):2643-2646.

［8］ Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN.Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，48(6):2047-2063.

［9］ Thorgeirsson SS，Lee JS，Grisham JW.Functional genomics of hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology，2006，43(2 Suppl 1):S145-S150.

［10］ Budhu A，Jia HL，F(xiàn)orgues M，et al.Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology，2008，47(3):897-907.

［11］ Ji J，Wang XW.New kids on the block:diagnostic and prognostic microRNAs in hepatocellular carcinoma ［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(18):1686-1693.

［12］ Bhattacharya SD，Garrison J，Guo H，et al.Micro-RNA-181a regulates osteopontin-dependent metastatic function in hepatocellular cancer cell lines［J］.Surgery，2010，148(2):291-298.

［13］ Frueht CS，Uduman M，Duke JL，et al.Gene expression analysis of Forskolin treated basilar papillae identifies mieroRNA-181a as a mediator of proliferation［J］.PLoS One，2010，5(7):e11502.

［14］ Lwin T，Lin J，Choi YS，et al.Follieular dendritic cell-dependent drug Resistance of non-Hodgkin lymPhoma involves cell adhesion-mediated Bim Down-regulation through induction of microRNA-181a［J］.Blood，2010，116(24):5228-5236.