馮愛強 李蕾蕾 張彥武 胡花麗 王 舉

細胞周期抑制蛋白（p27kip1）和S期激酶相關(guān)蛋白酶2（Skp2）是近年來發(fā)現(xiàn)的2個重要信號傳導分子，參與調(diào)控細胞增殖和凋亡，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。但其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的研究少見報道。本研究對40例乳腺癌組織中Skp2、p27kip1 mRNA進行檢測，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2009年10月—2011年5月于本科治療的乳腺癌患者40例，年齡23~67歲，平均年齡（50.18±12.65）歲。病理類型均為浸潤性導管癌，病理分期及組織學分級按WHO分期及分級標準，另取乳腺纖維腺瘤標本20例，以同期正常乳腺組織標本（取癌灶邊緣5 cm以上經(jīng)病理學檢查的正常乳腺組織）20例作為對照。所有組織標本均經(jīng)病理學證實，而且術(shù)前均未接受放療、化療及內(nèi)分泌等治療。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與處理 將新鮮組織標本1.5 g置于1.5 mL DEPC處理過的EP管中，立即置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織、正常乳腺組織均按Trizol一步法提取組織中的總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品的OD260/OD280值，觀察提取RNA樣品的純度并計算其含量。參照文獻[2]設計PCR引物，Skp2引物序列：上游5′-ATGTGACTGGTCG GTTGC-3′，下游5′-TCGATAGGTCCATGTGCT-3′，擴增產(chǎn)物片段長度120 bp；p27kip1引物序列：上游5′-AGCTTGCCC GAGTTCTACTA-3′，下游5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCT-3′，擴增產(chǎn)物片段長度325 bp。以葡萄糖醛酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，引物序列：上游5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游5′-CACAGTCTTCTGGTGGC-3′，擴增產(chǎn)物片段長度為540 bp。RT參照試劑盒（Takara公司）說明書操作，反應體系為10 mL，RNA模板量為1 μL，反應條件：30℃水浴10 min，42℃水浴30 min，99℃水浴5 min，5℃水浴5 min。PCR反應條件為94℃預變性2 min，94℃變性30 s，64℃復性30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。? μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠（0.5 mg/L）溴化乙錠染色上電泳，紫外燈下觀察成像。

1.2.3 表達結(jié)果判斷標準 PCR產(chǎn)物半定量分析用天能GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描凝膠，進行吸光度掃描和測定灰度，以GAPDH作為內(nèi)參照校正，用目的基因與GAPDH灰度比值表示目的基因的相對表達含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。與病理學參數(shù)關(guān)系采用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Figure 1 RT-PCR test results圖1 RT-PCR檢測結(jié)果

Table 1 Expressions of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA in breast carcinoma,breast fibroadenoma and normal tissues表1Skp2 mRNA與p27kip1 mRNA在乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤和正常組織中的表達 ±s）

Table 1 Expressions of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA in breast carcinoma,breast fibroadenoma and normal tissues表1Skp2 mRNA與p27kip1 mRNA在乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤和正常組織中的表達 ±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

組別正常乳腺組織（1）乳腺纖維腺瘤（2）乳腺癌（3）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）n 20 20 40 Skp2 0.114±0.002 0.267±0.073 0.529±0.325 22.000**0.132<0.001 0.004 p27kip1 0.779±0.145 0.673±0.124 0.519±0.251 111.820*0.201 0.001 0.020

2 結(jié)果

2.1 不同組織中Skp2、p27kip1 mRNA的表達 在乳腺組織中均可檢測到2種基因的表達。乳腺癌組織中Skp2 mRNA表達水平明顯高于乳腺纖維腺瘤和正常乳腺組織（P<0.05），而其在正常乳腺組織與乳腺纖維腺瘤的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；乳腺癌組織中p27kip1 mRNA的表達水平明顯低于乳腺纖維腺瘤組織和正常乳腺組織（P<0.05），而在正常乳腺組織與乳腺纖維腺瘤比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖1、表1。

2.2 乳腺癌組織中Skp2、p27kip1 mRNA表達與不同臨床病理因素的關(guān)系 Skp2 mRNA的表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織學分級呈正相關(guān)；p27kip1 mRNA的表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織學分級呈負相關(guān)；Skp2 mRNA、p27kip1 mRNA表達與患者年齡、絕經(jīng)狀況、腫瘤大小和病理學分期均無明顯相關(guān)性（P>0.05），見表2。

2.3 Skp2、p27kip1 mRNA表達的相關(guān)性 乳腺癌組織中Skp2 mRNA、p27kip1 mRNA相對表達水平呈負相關(guān)（r=-0.497，P<0.001）。

3 討論

P27kip1是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（CKI）家族的一員，可阻止細胞通過G1/S期而抑制細胞增殖[2]。Skp2是近來發(fā)現(xiàn)的Skp1-Cullin-F-box（SCF）E3酶復合體中的一種F-box蛋白，其包含的亮氨酸結(jié)構(gòu)域可與磷酸化的p27kip1結(jié)合，從而使后者進入泛素蛋白酶水解途徑降解[3]。

本研究結(jié)果表明，乳腺癌組織中Skp2基因顯著高于正常乳腺組織，p27kip1 mRNA表達顯著低于正常乳腺組織，提示Skp2基因激活，p27kip1基因失活可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要誘導因素,可能的機制是p27kip1基因表達降低時對G1/S調(diào)控點的抑制作用減弱，細胞加速進入S期，導致細胞增殖加快。而Skp2基因表達增加時加強了泛素蛋白酶水解途徑對p27kip1的降解，同樣導致p27kip1含量減少，對G1/S調(diào)控點的抑制作用減弱，細胞加速增殖。當細胞增殖失控時，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展就不可避免。

Skp2在許多人類惡性實體腫瘤中呈高表達[4]。Skp2在食管癌組織中呈高表達[5]。有文獻報道Skp2與p27kip1蛋白表達在人類許多惡性實體腫瘤中呈負相關(guān)[6]。Erkanli等[7]研究發(fā)現(xiàn)p27蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中表達較正常增殖期內(nèi)膜癌明顯降低，與病理分級、肌層浸潤深度等呈明顯的負相關(guān)，而p27kip1 mRNA在子宮內(nèi)膜癌中與病理分級、肌層浸潤深度等無明顯相關(guān)性[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Skp2 mRNA的表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級呈顯著正相關(guān)，p27kip1 mRNA的表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級呈顯著負相關(guān)，提示Skp2基因過度表達，p27kip1基因低表達，對判斷乳腺癌的惡性程度具有一定的促進作用。由此可推測，乳腺癌組織中Skp2基因表達水平越高，p27kip1基因表達水平越低時，可能導致其腫瘤分化程度越低，惡性程度越高，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越大，其侵襲能力和惡性程度就相對越高，緩解期越短。而腫瘤組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為預后不良的因素，可結(jié)合其他預后不良指標及高危因素綜合判斷預后及指導臨床治療。手術(shù)-病理分期指標也標志著腫瘤的侵襲與進展，但本研究未發(fā)現(xiàn)Skp2 mRNA和p27kip1 mRNA的表達與其有明顯的相關(guān)性，原因可能是乳腺癌期別較晚者，往往更多地選擇新輔助治療，而臨床無法獲得新輔助前的手術(shù)標本，使收集例數(shù)減少。因此，乳腺癌組織中Skp2基因表達上調(diào)，p27kip1基因表達下調(diào)，可能參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，為乳腺癌的早期基因診斷及基因靶向治療提供了參考。

Table 2 Correlation of Skp2 mRNA and p27kip1 mRNA expression in breast cancer tissues and clinical pathological factors表2 乳腺癌組織中Skp2 mRNA和p27kip1 mRNA的表達與臨床病理因素的關(guān)系

[1]Lin DI,Diehl JA.Mechanism of cell-cycle control:ligating the ligase[J].Trends Biochem Sci,2004,29（9）:453-455

[2]Heaney AP,Singson R,McCabe CJ,et al.Expression of pituitary-tu?mour transforming gene in colorectal tumours[J].Lancet,2000,355（9205）:716-719.

[3]Zhang H,Kobayashi R,Galaktionov K,et al.p19 skpl and p45 skp2 are essential elenments of the cyelin A-CDK2 Sphese kinase[J].Cell,1995,82(06):915-925.

[4]Nakayama KI,Katakeyama S,Nakayama K.Regulation of the cell cy?cle at the G1-S transition by proteolysis of cyclinE and p27kip1[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,28（4）:853-860.

[5]孫永剛，彭貴勇，唐郡，等.Skp2在食管癌組織中的表達及其臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學學報，2006,28（04）:368-370.

[6]趙君，楊春鹿.癌基因Skp2與人類惡性腫瘤[J].醫(yī)學綜述，2006,12（6）:325-327.

[7] Erkanli S,Kayaselcuk F,Kuscu E,et al.Expression of surviving,PTEN and p27 in normal,hyperplastic,and carcinomatous endome?triun[J].Int J Gynecol Cancer,2006,16（3）:1412-1418.

[8]祈秀娟，魏麗娜.Skp2和p27kip1在子宮內(nèi)膜樣癌組織中的表達[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2007,16(11):818-822.