王風芹，侯淑芬，謝 慧，于魯冀，宋安東

(1．河南農業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002;2．農業(yè)部農業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南鄭州450002;3．鄭州大學水利與環(huán)境學院，河南鄭州450002)

賈魯河是淮河的二級支流，發(fā)源于河南省新密市白寨鄉(xiāng)圣水峪，流經鄭州、中牟、開封、尉氏縣，于周口市入沙潁河，全長276．5 km，總流域面積5 896 km2［1］．賈魯河無清水來源，沿途又接納鄭州市和中牟縣的生活污水及工農業(yè)廢水，造成其水體污染嚴重，自凈能力差，水質屬劣Ⅴ類，氨氮及COD的排放量占沙穎河的1/3，已成為沙潁河流域污染最嚴重的河流，被國家和河南省政府列為流域環(huán)境綜合重點整治區(qū)域［2，3］．微生物作為水質評價的一個重要指標，能及時反映整個水生環(huán)境的變化［4］，對河流水體中的脫氮微生物數量進行檢測，可以間接反映該水域的脫氮能力與自凈能力．本研究利用傳統(tǒng)的微生物分離計數方法和DGGE技術研究了賈魯河水體及底泥微生物種群結構與多樣性的季節(jié)動態(tài)變遷特征，以期為制定賈魯河污水的生物治理方案提供理論依據．

1 材料與方法

1．1 樣品采集

選取賈魯河鄭州示范工程第七標段上游和下游作為2個取樣點，于2009-03—2009-12的春分、夏至、秋分、冬至4個時間點，參照文獻［5］的方法，分別取河流水體(距水表面0～40 cm，5點取樣混合均勻)和底泥(0～20 cm，5點取樣混合均勻)以備試驗．

1．2 微生物區(qū)系分析

1．2．1 細菌、真菌和放線菌數量測定 采用梯度稀釋平板法測定水樣和底泥樣品中的細菌、真菌和放線菌數量．培養(yǎng)基分別選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基，于28～30℃，分別培養(yǎng)2～3 d、3～5 d和5～7 d，計數并記錄結果．

1．2．2 脫氮功能微生物數量測定 采用最大或然數法(Most Probable Number，MPN)測定硝化細菌和反硝化細菌等脫氮功能微生物菌數．培養(yǎng)基分別采用硝化細菌培養(yǎng)基和反硝化細菌培養(yǎng)基．樣品稀釋梯度為 10-2，10-3，10-4，10-54 個梯度，每個梯度3個重復，接種量0．1 mL，并以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照，28～30℃靜置培養(yǎng)14 d后進行測定，培養(yǎng)基配方及試驗方法參見文獻［6］，查MPN表，計算．

1．3 16S rDNA PCR-DGGE 分析

1．3．1 16S rDNA V3 區(qū) PCR 擴增 采用 E．Z．N．A．TM Water/Soil DNA Kit Protocal(OMEGA)試劑盒提取水樣及底泥的宏基因組DNA，提取方法參照說明書．選用細菌的通用引物F341-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')［7～9］對水樣和底泥樣品的16s rDNA V3區(qū)進行PCR擴增．PCR擴增的反應體系如下:5 μL 10 × PCR Buffer(Mg2+15 mmol·L-1)、4 μL dNTP Mix(2．5 mmol·L-1)、1 μL 引物 F341-GC(10 μmol·L-1)、1 μL 引物 518 R(10 μmol·L-1)、0．5 μL Taq DNA 聚合酶、DNA模板10 ng，滅菌去離子水補至50 μL．PCR反應條件為:95℃下預變性3 min;94℃下變性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸45 s，28個循環(huán);94℃下30 s，56 ℃下30 s，72 ℃下延伸7 min．PCR 擴增產物經質量分數為1．0% 瓊脂糖凝膠檢測后，于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1．3．2 DGGE 將45 μL 的 PCR 產物和5 μL 6 倍加樣緩沖液混合，采用Bio-rad凝膠電泳系統(tǒng)，質量分數10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為30%～60%(100%的變性劑含7 mol·L-1尿素和40%去離子甲酰胺)，在200 V的電壓下，電泳10 min，使樣品快速跑出泳道后再在85 V電壓下，60℃，電泳14 h．電泳結束后，采用SYBR GreenⅠ染色，獲得DGGE指紋圖譜．

1．3．3 目的條帶的克隆與測序 分別切取DGGE圖譜中的目的條帶至不同的EP管中，以100 μL 70%的冰乙醇洗滌，重復2～3次，風干10 min后轉移至另一新的 EP管中，加50 μL滅菌去離子水，4℃靜置過夜;以此為模板，以 F341(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和 R518為引物進行PCR擴增，其PCR反應體系和擴增程序同1．3．1．PCR產物經凝膠檢測后，送北京鼎國生物技術有限公司測序．將測序結果進行處理后提交到GeneBank數據庫，采用BLAST進行目標序列和基因庫中所含序列的相似性分析，得到同源性最近的序列．

2 結果與分析

2．1 賈魯河不同季節(jié)水體微生物數量分布

賈魯河鄭州段示范工程第七標段上下游水體不同季節(jié)各類群微生物數量統(tǒng)計見表1．由表1可知，賈魯河水體中細菌數量最多，真菌次之，放線菌最少;上下游水體相比而言，細菌、放線菌和真菌數量未呈現(xiàn)規(guī)律性變化;硝化細菌和反硝化細菌數量基本相當，且下游數量略高于上游．賈魯河水體中各類群微生物夏秋季數量高于冬春季．

表1 不同季節(jié)水體微生物數量Table 1 Microbe population in the water column with various seasons CFU·mL-1

2．2 賈魯河不同季節(jié)底泥微生物數量分布

賈魯河不同季節(jié)上下游底泥中微生物數量分布情況見表2．由表2可知，底泥中細菌數量最高，其次是放線菌，真菌數量最少;硝化細菌和反硝化細菌數量基本相當．除冬季外，下游底泥中細菌數量顯著高于上游數量;放線菌和真菌上下游數量之間差別不明顯;夏秋季下游脫氮功能微生物數量顯著高于上游，冬春季差別不明顯．細菌、真菌和放線菌數量春夏季均略高于秋冬季，硝化細菌和反硝化細菌數量夏秋季高于冬春季．底泥中微生物數量季節(jié)變化較水體中微生物數量季節(jié)變化穩(wěn)定．

表2 不同季節(jié)底泥微生物數量Table 2 Microbe population in the sediment with various seasons CFU·g-1

2．3 底泥樣品中細菌16S rDNA DGGE分析

2．3．1 16S rDNA DGGE指紋圖譜分析 擴增底泥樣品中細菌16S rDNA的V3區(qū)進行DGGE指紋圖譜分析，明顯可見各樣品數量不等、強度不同的條帶(圖1)，春、夏、秋、冬四季微生物種群結構差異顯著，上下游底泥樣品在春、夏、秋、冬四季優(yōu)勢菌群均存在明顯的消漲變遷．

2．3．2 優(yōu)勢菌群鑒定結果 將DGGE圖譜中的5條優(yōu)勢目的條帶(圖1)回收、純化、測序，測得的16S rDNA V3區(qū)序列與GeneBank數據庫中的已知序列用BLAST進行檢索和同源性比較，結果見表3．

從表3可知，5個條帶中有4條在GenBank中找到與其同源性很高(＞98%)的相似種群．其中條帶1和條帶2為不可培養(yǎng)的未知種群細菌．條帶3與弓形菌屬(Arcobacter)親緣關系最近，同源性達100%．條帶4和條帶5均為擬桿菌(Bacteroidetes)，該種群微生物是活性污泥和好氧顆粒污泥系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群，在賈魯河水體自凈過程中可能起到重要作用．

圖1 賈魯河不同季節(jié)總細菌DGGE圖譜Fig．1 DGGE profile of total bacteria in Jalu River various seasons

表3 DGGE優(yōu)勢條帶的16S rDNA片段序列的比對結果Table 3 Comparison of 16S rDNA sequences in dominant DGGE bands by sequencing and BLAST analysis

3 結論與討論

微生物監(jiān)測是利用微生物資源對環(huán)境污染或變化所發(fā)生的反應，闡明環(huán)境污染狀況，從生物學角度為環(huán)境質量的監(jiān)測和評價提供依據．它不僅能反映多種因子污染的綜合效應，還能反映環(huán)境污染的歷史狀況，成為污染物的暴露與效應最靈敏的監(jiān)測指標，這對于環(huán)境污染的探查和快速篩選、環(huán)境健康的風險評價及污染物長期毒性效應的早期預報具有重要意義．

本研究發(fā)現(xiàn)賈魯河水體和底泥中細菌數量顯著高于真菌和放線菌數量，脫氮功能微生物硝化細菌和反硝化細菌數量相當;水體中各類群微生物數量及底泥中硝化細菌和反硝化細菌數量夏秋季高于冬春季，而底泥中細菌、真菌和放線菌數量春夏季略高于秋冬季．無論在水體還是底泥中，細菌總數在一年四季均達到了106CFU·mL-1以上，最高達到了109CFU·mL-1，表明賈魯河水質一年四季均處于嚴重污染狀態(tài)，為多污染帶．這與賈魯河暗渠多，大量生活污水和生產廢水廢物不斷排入關系巨大．

吳春篤等［10］對鎮(zhèn)江城市污水細菌多樣性及其生物安全性研究時發(fā)現(xiàn)，近似弓形桿菌屬(Arcobacter)的細菌比例高達74．2%，為城市污水中的主要優(yōu)勢菌群，進一步將其23S rDNA上的特異性序列進行PCR擴增后證實污水中的弓形菌屬為致病性弓形桿菌．本研究利用16S rDNA PCR-DGGE指紋圖譜分析，揭示出賈魯河底泥中四季微生物種群結構差異顯著，上下游底泥樣品在春、夏、秋、冬四季優(yōu)勢菌群均存在明顯的消漲變遷，且擬桿菌和弓形菌等是賈魯河底泥的優(yōu)勢微生物．弓形菌等致病性細菌的存在將威脅周邊群眾及畜禽的健康，因此對于賈魯河的污染治理應引起政府和科研部門的極大關注，制定相應的治理措施．

［1］ 盧 暇，蘇衛(wèi)濤，王 楠．賈魯河河道洪水計算［J］．河南水利與南水北調，2009(8):54．

［2］ 趙 輝，張建夫，謝東坡，等．賈魯河水質的變化規(guī)律研究［J］．周口師范學院學報，2005，22(5):68-70．

［3］ 高紅莉，李洪濤，趙鳳蘭．沙潁河(河南段)水污染的時空分布規(guī)律［J］．水資源保護，2010，26(3):23-26．

［4］ 陳國新．環(huán)境科學基礎［M］．上海:復旦大學出版社，1992:259-261．

［5］ 國家環(huán)境保護總局．水和廢水監(jiān)測分析方法［M］．北京:中國環(huán)境科學出版社，2002:38-42．

［6］ 李振高，駱永明，滕 應．土壤與環(huán)境微生物研究法［M］．北京:科學出版社，2008:92-103．

［7］ 劉恩科，趙秉強，李秀英，等．不同施肥制度土壤微生物量碳氮變化及細菌群落16S rDNA V3片段PCR產物的DGGE 分析［J］．生態(tài)學報，2007，27(3):1079-1085．

［8］ NAKATSU C H，TORSVIK V，?VREáS L．Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products［J］．Soil Science Society of A-merica Journal，2000，64:1382-1388．

［9］ MUYZER G，WAAL E C，UITTERLINDEN A G．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］．Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700．

［10］ 吳春篤，許小紅，寧德剛，等．城市污水細菌多樣性及其生物安全性研究［J］．中國安全科學學報，2008，18(1):119-122．