張紅瑞，馬彥秋，高致明，王文全

(1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450002;2．北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102)

黃芩為唇形科黃芩屬多年生草本植物，藥用部位為干燥根，主含黃酮類化合物，具有清濕熱、瀉火、解毒、安胎等功效［1］．黃芩分布于黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、河南、甘肅、陜西、山西、山東等地［2］．多年來黃芩藥源一直以野生為主，由于社會(huì)需求不斷增加，野生資源破壞嚴(yán)重［3］．經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同種源野生黃芩莖色有綠、紫兩種顏色，花有紫、白、粉色之分，在葉片大小、株高、分枝等形態(tài)學(xué)性狀上有較大變異．黃芩分子生物學(xué)方面的研究較為薄弱，主要是利用隨機(jī)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性分析(RAPD)［4，5］進(jìn) 行 分 子 遺 傳 多樣 性 研 究．由 于RAPD重復(fù)性較差，近年來，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，所用的PCR引物長(zhǎng)度在20個(gè)核苷酸左右，可以采用與常規(guī)PCR相同的反應(yīng)條件，穩(wěn)定性比RAPD好［6］．目前在藥用植物遺傳多樣性研究中也日趨增多［7～15］．本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)野生黃芩54個(gè)種源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行研究，為黃芩種質(zhì)資源的可持續(xù)利用和保護(hù)及品種選育等提供參考．

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為野生黃芩54個(gè)種源硅膠快速干燥保存的幼嫩葉片，種源來源見表1．

表1 黃芩種源來源Table 1 The resources of Scutellaria baicalensis wild provenances

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 DNA的提取 采用十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法提取DNA，步驟如下:1)將硅膠干燥的黃芩葉片在液氮中研成粉末，置于1．5 mL離心管中，加入600 μL SDS緩沖液，65℃水浴30～60 min;2)取出，加入 5 mol·L－1KAC 200 μL，冰水浴 10 min;3)取出，加入 V(氯仿)∶V(異戊醇)為 24∶1，充分混勻，室溫下靜置 10 min，10 000 r·min－1離心12 min;4)取上清液，加入600 μL異丙醇，混勻并靜置，10 000 r·min－1離心 3 min;5)倒掉上清液，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡，倒掉乙醇，將DNA干燥后加入200 μL雙蒸水溶解;6)紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA質(zhì)量濃度和相對(duì)純度，并將DNA 稀釋成 20 mg·L－1，備用．

1．2．2 ISSR引物篩選 本研究選用加拿大British Columbia大學(xué)提供的1套 (共100條)ISSR引物試劑盒(上海生工合成)，通過挑選來自3個(gè)種源的3個(gè)黃芩樣品，分別用100個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增．在所用的100個(gè)引物中，有34個(gè)引物能得到較好擴(kuò)增，這34個(gè)引物是808，810，811，812，813，814，815，817，821，823，824，825，827，830，840，841，845，846，847，850，851，852，858，859，860，866，873，878，880，881，889，890，891 和899．最終選擇了808等9條多態(tài)性較高的引物用于黃芩ISSR－PCR擴(kuò)增 (表2)．

1．2．3 ISSR－PCR 擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［16］，略有改動(dòng)．PCR 反應(yīng)體系為:dd H2O 14．1 μL;10 × PCR buffer 2．5 μL(含 Mg2+);dNTP(2．5 mmol·L－1)2．5 μL;ISSR 引物 (5 μmol·L－1)2．5 μL;Taq 酶(2．5 U)0．4 μL;模板 DNA(20 mg·L－1)3 μL;總反應(yīng)體積為25 μL．

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;94℃預(yù)變性1 min;52℃或54℃退火1 min;72℃延伸2 min;40個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸 7 min．整個(gè) ISSR－PCR反應(yīng)共6步，時(shí)間大約為3．2 h．

1．2．4 電泳與成像 PCR反應(yīng)產(chǎn)物取出后進(jìn)行1．6%的瓊脂糖凝膠電泳;電泳條件為:電壓，5 V·cm－1;時(shí)間，1．5 ～2 h．經(jīng) EB 染色后，在 Genesnap凝膠成像系統(tǒng)下照相．

1．2．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 在瓊脂糖凝膠上，每個(gè)材料的每一條電泳譜帶看作為一個(gè)遺傳位點(diǎn)，在同一個(gè)位點(diǎn)上如有強(qiáng)帶者或重復(fù)出現(xiàn)的弱帶者計(jì)為“1”，無帶者或不重復(fù)出現(xiàn)的弱帶者計(jì)為“0”，計(jì)算其總擴(kuò)增條帶和特異性擴(kuò)增條帶數(shù)量．利用SPSS 11．5軟件的類間平均鏈鎖法，計(jì)算供試材料的歐氏距離，進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建其聚類圖．

2 結(jié)果與分析

2．1 黃芩種源的ISSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果

用從100條引物中篩選出的擴(kuò)增條帶多、清晰和穩(wěn)定性好的9條引物對(duì)黃芩54個(gè)種源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，9條ISSR引物的擴(kuò)增位點(diǎn)為7～15個(gè)，共96個(gè)位點(diǎn)，擴(kuò)增位點(diǎn)的相對(duì)分子質(zhì)量為200～2 000 bp，其中多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)為5～12個(gè)，共77個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)占71．43% ～90．91%，平均值為 80．21%(表2)．

表2 黃芩ISSR引物及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 List of primers and the experiment results

2．2 黃芩種源DNA遺傳多樣性分析

黃芩54個(gè)種源的ISSR總擴(kuò)增條帶為31～56條，其中多態(tài)性擴(kuò)增條帶占18～43條(平均29．20個(gè)位點(diǎn))，多態(tài)性條帶比率為58．06% ～76．79%，平均值為68．73%，說明黃芩種源間的遺傳多態(tài)性水平差異較大，遺傳變異比較豐富．S49(吉林松原種源)的多態(tài)性擴(kuò)增條帶最多(43條)，占76.79%;而S4(河北承德豐寧Ⅲ種源)的最少(18條)，僅占58．06%(表3)．

2．3 黃芩種源的聚類分析

以類間平均連鎖法對(duì)全部供試材料進(jìn)行聚類，通過計(jì)算遺傳距離來構(gòu)建其聚類分析圖(圖1)．結(jié)果顯示，黃芩54個(gè)種源比較自然地分為3個(gè)分支，其中S49(吉林乾安種源)單獨(dú)為1個(gè)分支;S41(陜西佳縣種源)和S48(遼寧建昌種源)為1個(gè)分支;其余51個(gè)種源為1個(gè)分支．從圖1可見，吉林乾安種源與其他種源之間的遺傳距離相對(duì)較大，其親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn);從51個(gè)種源形成的1個(gè)分支中可以看到，地域相近的種源首先聚在一起，如S14(河北承德Ⅲ種源)和S18(河北隆化Ⅰ種源)，S19(河北隆化Ⅱ種源)和S20(河北隆化Ⅲ種源)，也存在很多地域相差甚遠(yuǎn)的種源聚在一起的現(xiàn)象，如S47(遼寧朝陽種源)和S54(山東淄博種源)．

圖1 黃芩54個(gè)種源ISSR聚類分析圖Fig．1 Dendrogram of cluster analysis for fifty-four kinds of Scutellaria baicalensis

表3 不同種源黃芩遺傳多樣性分析結(jié)果Table 3 Genetic diversities in different population of Scutellaria baicalensis

3 結(jié)論與討論

馮學(xué)鋒等［4］對(duì)13個(gè)居群62個(gè)黃芩(Scutellaria baicalensis)和并頭黃芩(Scutellaria scordifolia)樣本進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，黃芩遺傳變異和地理環(huán)境有關(guān)系．邵愛娟等［5］對(duì)34個(gè)黃芩(包括栽培和野生)種源進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果表明，黃芩種源間的遺傳背景較為復(fù)雜，在遺傳學(xué)上的分析結(jié)果與其外觀形態(tài)大體相似，但與地理分布沒有一定的相關(guān)性．ISSR具有多樣性豐富、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于生物多樣性鑒定研究［17］．本研究采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)54個(gè)野生黃芩種源進(jìn)行分析的結(jié)果表明，黃芩種源間的親緣關(guān)系與其地理位置有一定的聯(lián)系，地域相近的種源首先聚在一起，也存在地域相差甚遠(yuǎn)的種源聚在一起的現(xiàn)象．不同的標(biāo)記方法得到的結(jié)論并不完全一致．這是由于不同的方法是從不同的水平和角度分析種質(zhì)間的差異，所得到的結(jié)果就不可能是簡(jiǎn)單的重復(fù)或絕對(duì)的一致．在具體的研究中，應(yīng)相互結(jié)合和印證，才能比較全面地解釋研究結(jié)果．

近年來，由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)黃芩藥材和黃芩苷的需要量日益增加，野生黃芩資源破壞嚴(yán)重，在1987年頒布的《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》里，黃芩被列為3級(jí)保護(hù)物種．本研究結(jié)果顯示，野生黃芩種內(nèi)具豐富的遺傳變異，其多態(tài)性擴(kuò)增位點(diǎn)80．21%．馮學(xué)鋒等［4］的研究結(jié)果顯示，黃芩居群間的遺傳變異占總變異的18．83%，居群內(nèi)變異占81．17%．邵愛娟等［5］的研究結(jié)果表明，不同種源黃芩(包括栽培和野生)間具有豐富的遺傳多樣性．說明導(dǎo)致野生黃芩資源不斷減少并非是其遺傳變異降低所致，人為過度采收和賴以生存的生態(tài)環(huán)境被破壞是中國(guó)野生黃芩資源急劇減少的主要因素．因此保護(hù)黃芩原產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境和適度采收野生黃芩資源是恢復(fù)野生黃芩種群數(shù)量和蘊(yùn)藏量最有效的途徑．

黃芩在中國(guó)分布較廣，特別是中國(guó)東部、西部氣候差異較大，生態(tài)環(huán)境各異，造成了豐富多樣的黃芩野生種群，為黃芩品種選育提供了很好的基因資源，有望從中培育出符合人們需要的優(yōu)良品種．至于黃芩遺傳基因與其形態(tài)變異的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究．

［1］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典:1部［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:282－283．

［2］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志:第65卷，第2分冊(cè)［M］．北京:科學(xué)出版社，1977:136－249．

［3］ 楊 全，白 音，陳千良，等．黃芩資源現(xiàn)狀及可持續(xù)利用的研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(7):1159 －1160．

［4］ 馮學(xué)鋒，胡世林，郭寶林，等．黃芩種群遺傳多樣性初步研究［J］．世界科學(xué)技術(shù)—中藥現(xiàn)代化，2002，4(4):38－43．

［5］ 邵愛娟，李 欣，黃璐琦，等．不同種源黃芩的RAPD分析［J］．中國(guó)中藥雜志，2006，31(6):452 －455．

［6］ 王建波．ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用［J］．遺傳，2002，24(5):613 －616．

［7］ 周延清，景建洲，李振勇，等．懷區(qū)地黃遺傳多樣性的ISSR 鑒定［J］．中草藥，2005，36(2):257 －261．

［8］ 羅 群，馬丹煒，王躍華．川烏遺傳多樣性的ISSR鑒定［J］．中草藥，2006，37(10):1554 －1557．

［9］ 何 俊，楊柏云，陳少風(fēng)，等．多葉重樓遺傳多樣性的ISSR分析［J］．云南植物研究，2007，29(4):388－392．

［10］ 李 靖，程 舟，楊曉伶，等．人參農(nóng)家類型遺傳多樣性的ISSR 分析［J］．中草藥，2007，38(9):1392－1395．

［11］ 孫 群，佟漢文，吳 波，等．不同種源烏拉爾甘草形態(tài)和ISSR遺傳多樣性研究［J］．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8(1):56 －63．

［12］ 關(guān) 錳，白成科，劉 嬌，等．不同山茱萸種質(zhì)資源形態(tài)和ISSR遺傳多樣性研究［J］．分子植物育種，2008，6(5):912 －920．

［13］ 王曉慧，湯曉闖，楊恩秀，等．莪術(shù)不同種和居群的ISSR－PCR分析［J］．中國(guó)中藥雜志，2008，33(18):2037－2040．

［14］ 羅玥佶，伍賢進(jìn)，彭 帥，等．12種翻白草種質(zhì)資源遺傳多樣性的 ISSR 分析［J］．中草藥，2008，39(5):748－751．

［15］ 包英華，白 音，田新波，等．束花石斛種質(zhì)資源的ISSR 分析［J］．廣西植物，2008，28(4):447－450．

［16］ 張文清．黃芩優(yōu)良種源的篩選及其與基因組相關(guān)性研究［D］．北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2007．

［17］ 林萬明．PCR技術(shù)操作和應(yīng)用指南［M］．北京:人民軍醫(yī)出版社，1993:7－14．