劉 旭

(咸寧衛(wèi)校附屬醫(yī)院，湖北 咸寧 437100)

多數(shù)研究報(bào)道［1，2］，在眾多致纖維化細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGF-β1)是公認(rèn)最重要的調(diào)控因子。TGF-β1可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞(FB)過(guò)度增殖、分化，繼而促進(jìn)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肺間質(zhì)和肺泡間過(guò)度積聚，導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展。PI3K/AKT是人體細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。它介導(dǎo)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、分化、死亡，甚至細(xì)胞間功能同步等多種細(xì)胞過(guò)程。PI3K信號(hào)通路主要由激活粘附斑激酶(FAK)、PI3K、Akt等構(gòu)成，它們通過(guò)調(diào)節(jié)整合素等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞增殖、遷移和粘附等功能，甚至能夠增加I型膠原蛋白的表達(dá)。近來(lái)研究表明［3］:TGF-β1可以激活 PI3K 信號(hào)途徑，并且通過(guò)該信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、分泌產(chǎn)生影響。目前，TGF-β1與PI3K信號(hào)通路的關(guān)系如何影響肺纖維化具體機(jī)制尚不清楚，本研究即針對(duì)該機(jī)制在肺纖維化過(guò)程中的影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器

健康雌性6周齡KM小鼠88只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鹽酸博來(lái)霉素(BLM)粉劑購(gòu)自日本花藥株式會(huì)社;PI3K抑制劑 LY294002，特異性抗體 anti-PI3K/P85alpha，TGF-β1 特異性抑制劑 SB-431542，TGF-β1 購(gòu)自Santa Cruz公司;人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)系HFL-I細(xì)胞株(中科院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PF 制備模型及分組

將88只小鼠隨即分為實(shí)驗(yàn)組76只(隨即分為T(mén)GF-β1亞組、LY294002亞組，各28只，對(duì)照亞組20只)、空白組12只。造模方法參照文獻(xiàn)，氣管內(nèi)注射BLM3.5mg/kg，空白組同法經(jīng)氣管內(nèi)注入相應(yīng)體積的生理鹽水。TGF-β1亞組為:聯(lián)合TGF-β1+SB-431542 組，單純 TGF-β1 組，隨機(jī)各14只;LY294002亞組為:聯(lián)合 TGF-β1+LY294002組，隨機(jī)各14只;對(duì)照亞組為:相同體積鹽水，其中 TGF-β1，SB-431542，LY294002 濃度為我們預(yù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)數(shù)據(jù)，即 TGF-β1:100pmol/L，SB-431542:100mmol/L，LY294002:15μmol/L。造模后第3、7、14、28d分別處死4組小鼠各3只，取出并分離其肺組織備用。

1.2.2 肺組織的處理

氯氨酮腹腔注射麻醉后無(wú)菌開(kāi)胸，于右心室插入套管針，拔去針頭，左心耳剪一3mm左右切口，同時(shí)套管與輸液器相連，向右心室灌注加入肝素的生理鹽水，直至肺臟發(fā)白，血管沖洗干凈;分離左肺下葉，注入4%多聚甲醛2ml見(jiàn)胸膜展平;結(jié)扎氣管后固定。常規(guī)酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，片厚5μm;用37℃生理鹽水灌洗右肺6次，回收灌洗液。經(jīng)無(wú)數(shù)紗布濾過(guò)后，放入無(wú)菌離心管中，經(jīng)離心、甩片及HE染色;余組織－80℃凍存。用于Western-blot及應(yīng)用氯氨T氧化-比色法檢測(cè)羥脯氨酸(HYP)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法

通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè) TGF-β1亞組、LY294002亞組、對(duì)照亞組、空白組PI3K蛋白的表達(dá)，Anti-PI3K/P85:1∶150。應(yīng)用雙盲法進(jìn)行評(píng)估，SABC染色法(×100)，結(jié)果以棕黃色連續(xù)或灶性顆粒分布為表達(dá)陽(yáng)性，在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡(400×)視野計(jì)數(shù)，每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)100個(gè)，共1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。根據(jù)染色強(qiáng)度著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)積分之積判斷結(jié)果，即:≤4分為(－);＞4且≤8為(+);＞8且≤12為(++);＞12且≤16為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)檢查

博來(lái)霉素注射后3d，HE染色(×40)，實(shí)驗(yàn)組各組小鼠肺小血管擴(kuò)張、充血、肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多，空白組小鼠無(wú)明顯變化。7d后，單純TGF-β1，對(duì)照組，兩組小鼠肺間隔輕中度間質(zhì)細(xì)胞增多及膠原樣物質(zhì)明顯增生，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂;聯(lián)合 TGF-β1+SB-431542組，聯(lián)合TGF-β1+LY294002組兩組膠原物質(zhì)繼續(xù)增生，空白組無(wú)明顯變化。14～28d，單純TGF-β1組肺間隔明顯增寬，肺泡間隔內(nèi)成纖維細(xì)胞及膠原樣物質(zhì)明顯增多，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、萎陷;聯(lián)合TGF-β1+SB-431542 組，聯(lián)合 TGF-β1+LY294002組，對(duì)照組三組小鼠肺泡間隔繼續(xù)增寬，空白組變化不明顯。單純TGF-β1組，羥脯氨酸(HYP)量明顯高于其他兩實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(P＜0.01);聯(lián)合F-β1+SB-431542、TGF-β1+LY294002 組及對(duì)照組明顯高于空白組(P＜0.05)。

2.2 TGF-β1 亞組、LY294002 亞組、對(duì)照亞組、空白組PI3K蛋白表達(dá)

PI3K主要分布在細(xì)胞核外，呈棕黃色(圖1)，經(jīng)分析可知，TGF-β1組PI3K表達(dá)明顯高于其余3組，同時(shí)TGF-β1+LY294002組亦高于空白組，并且對(duì)照組也高于空白組。

圖1 免疫組化觀察PI3K表達(dá)及分布(SABC×100)

3 討論

近年來(lái)［4～6］，許多研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化疾病越來(lái)越成為威脅人們身體健康的重要疾病之一，國(guó)內(nèi)外關(guān)于肺纖維化發(fā)展機(jī)制的研究也一直比較熱門(mén)。較為認(rèn)可的觀點(diǎn)是:肺成纖維細(xì)胞是肺纖維化發(fā)展過(guò)程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，其承擔(dān)著合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)肺纖維化過(guò)程以過(guò)度增生、合成膠原增多為主要特征。有研究證實(shí):TGF-β1是促成成纖維細(xì)胞形成的關(guān)鍵因子，是膠原合成最直接和有效的刺激劑。甚至有報(bào)道稱(chēng):肺內(nèi)高濃度TGF-β1會(huì)導(dǎo)致肺組織細(xì)胞外基質(zhì)沉積顯著增加。目前關(guān)于TGF-β1促成肺成纖維化細(xì)胞激活的具體機(jī)制了解仍然不夠透徹，但有研究報(bào)道，其可能與Smad家族的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，并且受到多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等調(diào)控，如PI3K等。

PI3K已發(fā)現(xiàn)可參與多種信號(hào)通路［6～8］，調(diào)節(jié)細(xì)胞各種功能。被激活時(shí)可作為第二信使結(jié)合并激活多種細(xì)胞內(nèi)靶蛋白，組成一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。近年來(lái)，關(guān)于PI3K信號(hào)系統(tǒng)在肺相關(guān)疾病發(fā)展過(guò)程中的研究較熱，主要發(fā)現(xiàn)其是多種生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑關(guān)鍵分子，多種生長(zhǎng)因子通過(guò)它調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分泌、合成等。

本研究以TGF-β1與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)通路重要信號(hào)分子PI3K關(guān)系為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，探討TGF-β1通過(guò)PI3K調(diào)控肺纖維化進(jìn)展的可能機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，利用博來(lái)霉素能夠成功構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組肺纖維化發(fā)展過(guò)程呈現(xiàn)出典型的疾病過(guò)程，早期以肺泡炎癥為主，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，繼而多形核白細(xì)胞、單核/巨核細(xì)胞等侵潤(rùn)，肺泡間隔增寬，肺組織結(jié)構(gòu)受損，為典型肺泡炎期;7～14d期間，實(shí)驗(yàn)組肺纖維組織增生，尤其 TGF-β1 最為明顯，TGF-β1+LY294002組肺纖維組織相對(duì)較少;28d時(shí)，TGF-β1組，小鼠穩(wěn)定肺纖維化形成，肺結(jié)構(gòu)完全紊亂，炎性細(xì)胞明顯減少;而TGF-β1+LY294002組，小鼠炎性細(xì)胞依然較多，肺結(jié)構(gòu)依然較清晰，但肺纖維化組織繼續(xù)增多。通過(guò)分析對(duì)比各組羥脯氨酸(HYP)量的變化，也證實(shí)我們病理觀察結(jié)果，于14～28d期間，TGF-β1 組明顯高于 TGF-β1+LY294002 組，并且兩者都顯著高于空白組(P＜0.05)。

結(jié)論提示:TGF-β1是肺纖維化進(jìn)展過(guò)程中重要的因素，這與多數(shù)研究報(bào)道相符，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PI3K可能可以影響TGF-β1促肺纖維化形成的進(jìn)程，其可能是TGF-β1促肺纖維化形成的重要機(jī)制之一。

在隨后我們的分析中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)對(duì)照組，空白組、實(shí)驗(yàn)各組PI3K明顯高表達(dá)，表明PI3K參與肺纖維化形成，是肺纖維化進(jìn)展過(guò)程中重要的因素，同時(shí)通過(guò)分析 TGF-β1組與 TGF-β1+LY294002組，發(fā)現(xiàn)無(wú)論病理結(jié)果抑或HYP量的變化，后者都明顯下降，在肺纖維化中后期表現(xiàn)尤為明顯［8～10］，這說(shuō)明抑制 PI3K 可以影響肺纖維化發(fā)展，阻礙 TGF-β1促肺纖維化形成，提示 PI3K是TGF-β1促肺纖維化形成機(jī)制的重要信號(hào)分子。肺纖維化是一種慢性進(jìn)行性疾病，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)理尚不十分清楚，探討闡述其發(fā)病機(jī)制迫在眉睫。本研究通過(guò)對(duì)PI3K與TGF-β1在肺纖維化過(guò)程中作用進(jìn)行研究，部分地闡述了生長(zhǎng)因子影響肺纖維化的機(jī)制，為人們開(kāi)展控制和治療肺纖維化疾病提供了重要理論依據(jù)。

［1］Kogan EA，Tyong FV.The mechanism of lung tissue remodeling in the progression of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Arkh Patol，2010，72(4):30

［2］Liu R，Ahmed KM.Therapeutic effects of alipoic acid on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats［J］.Int JMol Med，2007，19:865

［3］Wynn TA.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］.Pathol，2008，214(2):199

［4］Moeller A，Ask K.The bleomycin animal model:a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(3):362

［5］Kagan HM.Intra-and extracellular enzymes of collagen biosynthesis as biological and chemical targets in the control of fibrosis［J］.Acta Trop，2000，77(1):147

［6］Grimsby JL，Lucero AH.Role of lysyl oxidase propeptide in secretion and enzyme activity［J］.J Cell Biochem，2010，111(5):1231

［7］CHEN LJ，LI WD.Bleomycin induces upregulation of lysyl oxidase in cultured human fetal lung fibroblasts［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(5):554

［8］孫旭明，何振華，陳林.肺間質(zhì)纖維基質(zhì)重建與肺纖維化的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2011，6(24):242

［9］Khalil N，Perkeh TV，O’Connor R，et al.The regulation of TGF-β1 in idiopathic pulmonary fibrosis by the activation of latent TGF-β1 and differential expression of TGF-β receptors［J］.Thorax，2001，56:907

［10］Hashimoto S，Gon Y，Takeshita I，et al.Transforming growth factor-β1 induces phenotypicmodulation of human lung fibroblasts to myofibroblastthrough a c-Jun-NH2-terminal kinase-dependent pathway［J］.Am JRespir Crit Care Med，2001，1163:152