楊穎　袁斌　周春陽

【摘要】目的：探討黃酮類化合物柚皮苷對動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）大鼠主動脈過氧化物酶體增殖物激活受體-δ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorsδ，PPAR-δ）、內(nèi)皮細胞黏附分子1（vascularcelladhesionmolecular-1，VCAM-1）表達水平的影響。方法：通過喂養(yǎng)高脂飼料造成動脈粥樣硬化的大鼠模型。實驗動物分為正常對照組，AS模型組和柚皮苷AS組。實驗結(jié)束后測定血中甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白的水平，應(yīng)用RT-PCR法檢測大鼠主動脈PPAR-δ、VCAM-1的基因表達。結(jié)果：柚皮苷AS組血中甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白的水平比AS模型組明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高（P<0.01）；柚皮苷AS組主動脈PPAR-δ的基因表達高于模型組，而VCAM-1的基因表達則低于模型組（P<0.05）；結(jié)論：柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上調(diào)主動脈PPAR-δ的基因表達，下調(diào)VCAM-1的基因表達，可能為其抗AS的機制之一。

【關(guān)鍵詞】柚皮苷；動脈粥樣硬化；過氧化物酶體增殖物激活受體-δ；內(nèi)皮細胞黏附分子-1

AS是目前心血管疾病主要的死亡原因，發(fā)病機制主要為損傷-反應(yīng)學說。在長期高脂血癥情況下，增高的脂蛋白對動脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性的損傷，使得單核細胞黏附、遷移、吞噬，最終形成脂質(zhì)條紋[1]。因此脂蛋白的代謝、細胞的黏附是其中兩個重要的環(huán)節(jié)。

PPAR-δ作為過氧化物酶增殖體激活受體（PPAR），是一類基因轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族[2]。現(xiàn)階段認為，PPAR-δ在脂肪代謝，改善胰島素抵抗和抗血管炎癥反應(yīng)中起著重要作用[3]。

VCAM-1是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管內(nèi)皮細胞表達，在高血脂刺激AS形成過程中，能促進免疫細胞浸潤，使單核細胞和淋巴細胞粘附于血管內(nèi)皮[4]。

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，在某些傳統(tǒng)中藥及水果中含量豐富，如枳實，骨碎補，柚、橘類果皮及汁等中。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷具有非常廣泛的藥理作用，主要表現(xiàn)為抗炎、抗氧化及抗動脈粥樣硬化[5-6]。

本實驗擬在觀察柚皮苷對AS大鼠主動脈PPAR-δ、VCAM-1基因表達的影響。

1材料與方法

1.1藥品與試劑柚皮苷由陜西慧科植物開發(fā)有限公司提供、膽酸淮北市創(chuàng)凱生化原料廠提供、膽固醇成都科龍化工試劑廠提供、丙基硫氧嘧啶蘇州恒益醫(yī)藥原料有限公司提供、豬油來自市售板油煉制、羧甲基纖維素（CMC）上?；瘜W試劑采購供應(yīng)站提供、Trizol溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR檢測試劑盒由大連寶生物有限公司提供、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇測定試劑盒由浙江東甌生物工程有限公司提供。

1.2檢測儀器日立7170S全自動生化分析儀，ABIPRISM7000熱循環(huán)儀。

1.3動物SPFSD雄性大鼠共40只，體重（220±20）g[四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供，合格證號（SCXK川2006-14）]。實驗由川北醫(yī)學院藥物研究所SPF級動物實驗室完成。

1.4方法

1.4.1動物分組給藥動脈粥樣硬化飼料配方，脂肪乳劑：豬油20%，膽固醇10%，膽酸鈉2%，丙基硫氧嘧啶1%，吐溫-8020%，丙二醇30%加水至100%。動物分為3組，一組給普通飼料，另兩組給予AS飼料，共12周，后改喂普通飼料。然后分別灌胃給藥，普通飼料組及AS對照組（為0.5%CMC溶劑對照）、柚皮苷AS組（柚皮苷10mg/100g），給藥容量為1ml/100g體重，每天1次，連續(xù)8周，藥物均以0.5%CMC配制。

1.4.2主動脈留取實驗結(jié)束后乙醚麻醉動物，剖開胸腹腔，腹主動脈取血，離心（3500rpm）5min取血清備用。取全主動脈，剝離外膜脂肪組織，用于提取RNA。

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄PCR將大鼠主動脈標本研磨勻漿后，移入EP管，采用氯仿-酚法抽提RNA。隨后RNA變性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.4熒光定量PCR檢測引物由英俊公司合成。PPAR-δ引物序列，上游引物：5-GTTCGCCAAGGTGCTCCAG-3；下游引物：5-GCTCATATCTGTCTCCGTCTTCTT-3。VCAM-1引物序列，上游引物：5-GGAGACACTGTAATTATCTCCTG-3；下游引物：5-TCCTTTCATGTTGGCTTTTCTTGC-3。GAPDH引物序列，上游引物：5-CTCCCATTCCTCCACCTTG-3。下游引物：5-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3。取1μlcDNA為模板，上游引物和下游引物各0.2μl，反應(yīng)體系為10μl。采用兩步法進行RT-PCR擴增，并進行熒光檢測。目的基因表達量的相對水平，△△CT=△CT（test）-△CT（calibrator），其中△CT（test）=CT（target，test）-CT（ref，test）；△CT（calibrator）=CT（target，calibrator）-CT（ref，calibrator）。

1.4.5血清脂質(zhì)指標測定采用全自動生化儀測定血清甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、高密度脂蛋白（highdensitylipoproteincholesterol，HDL）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein-cholesterol，LDL）及極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein-cholesterol，VLDL）的水平。

1.5統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析。組間顯著性檢驗采用ANOVA，兩組之間的顯著性檢驗結(jié)果采用independentt-test，方差齊性檢驗采用LevenesTest。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1血脂結(jié)果AS對照組與常規(guī)飼料組比較，血脂指標均顯著升高（表1）。

2.2柚皮苷對血脂的影響血脂水平比較：與AS對照組相比，柚皮苷AS組TG、TC、VLDL水平明顯降低，HDL水平明顯增高（P<0.01）（表2）。

2.3熒光定量結(jié)果熒光RT-PCR檢測結(jié)果表明，與AS對照組比較，柚皮苷AS組主動脈PPAR-δmRNA表達增高，VCAM-1mRNA表達降低（P<0.05）（表3）。

3討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，與AS對照組相比，給予柚皮苷的AS組大鼠血中TC、TG、VLDL水平明顯降低，HDL水平增高。柚皮苷具有廣泛的生物活性。在脂代謝方面，在給予柚皮苷6個星期后，動物可表現(xiàn)為肝臟膽固醇合成降低，HDL-C/TC比例升高，HDL-C無變化，動脈硬化指數(shù)降低[7]。研究證實，柚皮苷能降低2型糖尿病小鼠肝臟中脂肪酸合酶和葡糖糖-6-磷酸脫氫酶的水平[8]。這些可能與下調(diào)脂酰輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，增加糞便甾醇類物質(zhì)排出等有關(guān)[7]。

實驗中進一步檢測了實驗大鼠主動脈PPAR-δ、VCAM-1mRNA的表達。發(fā)現(xiàn)與AS對照組相比，給藥組大鼠主動脈PPAR-δ的基因表達增加，而VCAM-1的基因表達下降。在離體細胞實驗中報道柚皮苷可能通過PPAR-γ抑制脂肪細胞分化相關(guān)基因的表達，從而抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化[9]。動物實驗中發(fā)現(xiàn)給予柚皮苷或柚皮素后，2型糖尿病小鼠的脂肪細胞、肝臟和腎臟組織中PPAR-γ的表達上調(diào)[8，10]。給予選擇性PPAR-δ激動劑GW501516以后，罹患代謝綜合征的印度恒河猴血中TC、HDL的濃度增加，TG和胰島素的水平降低[11]。

柚皮苷對VCAM-1的作用報道不一。在LeeCH等對高脂模型家兔的實驗中發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可降低胸主動脈VCAM-1和單核細胞化學趨化蛋白-1的表達[12]。Jeong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，毛地黃黃酮等黃酮類物質(zhì)可抑制ox-LDL活化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達VCAM-1和E-選擇素。而KimSW等在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)，事先給予柚皮苷刺激后細胞間黏附分子水平增加，但VCAM-1和E-選擇素無明顯變化[14]。本實驗結(jié)果與前兩者一致。

綜上所述，實驗中發(fā)現(xiàn)柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上調(diào)主動脈PPAR-δ的基因表達，下調(diào)VCAM-1的基因表達，可能通過影響脂蛋白代謝和細胞黏附達到抗AS的作用。

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（收稿日期：2012-11-06）（本文編輯：車艷）