郭喜軍 曹 旭 梁 京 河北省中醫(yī)院消化內(nèi)科（石家莊050011）

膽汁反流性胃炎（bile－reflux gastritis，BRG）隨著胃鏡的普及，檢出率大大增加，成為消化系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及病因多種，包括胃腸動(dòng)力紊亂，膽囊功能障礙及胃腸激素異常等。目前中醫(yī)藥對(duì)此病研究很多，但很少?gòu)臐岫玖⒄撨M(jìn)行研究。李佃貴教授創(chuàng)立的“濁毒理論”為膽汁反流性胃炎的中醫(yī)藥治療提供了新的治療思路，濁毒是當(dāng)前中醫(yī)病因病機(jī)研究的一個(gè)重要內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立膽汁反流性胃炎大鼠濁毒證模型，從而來(lái)研究濁毒在膽汁反流性胃炎發(fā)病過(guò)程中的有關(guān)機(jī)制，以期為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠30只，體重180～200g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：1105033。

1.2 試 劑 將牛黃胴酸鈉2.5g（鄭州利偉生物實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)20110206）、胰酶1.5g（美國(guó) GIBCO公司，批號(hào)27250018）、卵磷脂0.25g（瑞士 ACROS公司，批號(hào) A0277637）溶于蒸餾水100mL中配制成膽汁液。石家莊行唐棗木杠酒（酒精含量為75%）。SOD與MDA試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。TNF－α檢測(cè)試劑盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 LRI－I－800－GS人工氣候箱為廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；YC－DZ0z亞都超聲加濕器為北京亞都科技股份有限公司產(chǎn)品；HM－200電子天平；TDL－5－A離心機(jī)上海安亭產(chǎn)品；MDF－382E超低溫保存箱日本三洋；LGL－10臺(tái)式冷凍干燥機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；NW10VF超純水機(jī) 上海力康HeaLForce；DY89－1電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FJ－2021γ－放射免疫計(jì)數(shù)器西安二六二廠，等。均由河北中醫(yī)學(xué)院提供。

2 方 法 2.1 動(dòng)物分組及造模 30只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、濕熱證組（B組）、濁毒證組（C組）。各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)7d。對(duì)照組正常飼養(yǎng)。模型組參照柴氏[1]的方法并稍加改動(dòng)。即濕熱證組除用上述配制好的膽汁液灌胃外，將大鼠放入溫度（38±2）℃、相對(duì)濕度（93±2）%的人工氣候箱中，安排肥甘污染飼料喂養(yǎng)（將其昨日糞便、豬油、花生油、標(biāo)準(zhǔn)飼料以配比1∶1∶1∶100研碎，混合均勻）10d。濁毒證組除濕熱證組方法造模外另加5%乙醇溶液和0.5%辣椒水溶液隔日給予以代替飲水，并延長(zhǎng)造模時(shí)間，比濕熱證組多造模10d。

2.2 一般表現(xiàn)觀察 大鼠外觀、精神狀態(tài)及食量、體重、糞便形狀等。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法 據(jù)文獻(xiàn)[2，3]各組動(dòng)物于末次灌胃后，禁食不禁水24h，斷頭取血2mL，在4℃，4 000r/rain條件下離心10min，取上清液，－20℃凍存，留作TNF－α檢測(cè)，測(cè)定方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。采血后快速剖取胃組織，在低溫生理鹽水液中洗去血液，沿胃大彎剪開(kāi)，用冰生理鹽水漂洗胃內(nèi)容物，濾紙吸干，切取胃竇組織一塊，立即投入4%甲醛溶液內(nèi)固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下組織形態(tài)觀察。用刀片刮取余下的胃竇組織粘膜并稱重，冰浴下制備10%組織勻漿，3000r/min離心15min，取上清，－20℃以下保存，留作SOD、MDA檢測(cè)，測(cè)定方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

3 結(jié) 果 3.1 一般表現(xiàn)情況 正常組在喂養(yǎng)期間一般情況良好。濕熱證組大鼠前7d體重量增加，開(kāi)始造模后體重未有明顯增長(zhǎng)，面背部毛色枯槁，耳尾色白、毛無(wú)光澤，大便時(shí)干時(shí)溏，活動(dòng)狀態(tài)不佳。濁毒證組大鼠前7d體重增加，開(kāi)始造模后食量明顯減少，體質(zhì)量減輕，精神萎靡，嗜臥懶動(dòng)，全身毛色枯槁萎黃，形體逐漸偏瘦，溏便，出現(xiàn)受驚動(dòng)時(shí)無(wú)神，抓取時(shí)掙扎無(wú)力。

3.2 胃黏膜病理組織學(xué)結(jié)果 光鏡觀察正常組黏膜上皮完整，結(jié)構(gòu)排列清楚，固有黏膜密集排列的腺體，未見(jiàn)胃黏膜萎縮脫落或缺損，未見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張及潰瘍。濕熱證組胃黏膜上皮細(xì)胞層未變薄、有脫落，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有毛細(xì)血管擴(kuò)張充血。濁毒證組胃黏膜上皮細(xì)胞萎縮、脫落、糜爛，胃粘膜腺體和腺細(xì)胞減少，腸化生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)、部分有淋巴濾泡形成。

3.3 各組胃黏膜SOD、MDA及血清TNF－α含量 與正常組比較，濕熱證組和濁毒證組血TNF－α及胃黏膜MDA含量均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)濁毒證組較濕熱證組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，濕熱證組和濁毒證組胃黏膜SOD含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。同時(shí)濁毒證組較濕熱證組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如表1。

表1 各組TNF－α、MDA、及SOD結(jié)果的比較±s）

表1 各組TNF－α、MDA、及SOD結(jié)果的比較±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與濕熱證組比較，▲P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

組別 n TNF－α（ng/mL）MDA（u/mg prot）SOD（nmol/mg prot）正常對(duì)照組10 0.31±0.02 0.48±0.9 226±53濕熱證組 10 0.51±0.04△▲ 0.96±1.2△▲ 157±32△▲濁毒證組 10 0.78±0.07△▲ 1.22±1.8△▲ 129±21△▲

4 討 論 膽汁反流性胃炎（BRG）在臨床上隨著胃鏡的廣泛應(yīng)用，檢出率逐年增加，成為慢性胃炎的一種常見(jiàn)類型。BRG可歸屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)胃脘痛、嘈雜、嘔膽等范疇。近年來(lái)國(guó)內(nèi)的中醫(yī)學(xué)者對(duì)該病的辨治進(jìn)行了多方面探索，李佃貴教授創(chuàng)立的“濁毒理論”為本病的中醫(yī)藥治療提供了新的治療思路，應(yīng)用濁毒理論辨證論治在臨床上取得了良好的效果。但是缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)以“濕熱久居蘊(yùn)成濁毒”為理論依據(jù)，分別建立濕熱和濁毒模型，觀察和檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，從而為濁毒理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

濕熱蘊(yùn)久可化生濁毒。本實(shí)驗(yàn)中模型的建立就在濕熱證組的基礎(chǔ)上刻意延長(zhǎng)了濁毒證組的造模時(shí)間，并且在大鼠平時(shí)飲水中加入了助濕生熱之大辛大熱的白酒和辣椒水。病理切片和檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果均為濁毒證組較濕熱證組嚴(yán)重，提示了濕熱證蘊(yùn)久逐漸向濁毒證發(fā)展的病理變化過(guò)程。李佃貴[4]認(rèn)為濁毒互結(jié)，濁以毒為用，毒以濁為體，膠著難愈，邪壅經(jīng)絡(luò)，氣機(jī)不暢，邪不得散，血不得行，津不得布，津血停留，化生痰濁瘀血，日久痰濁、瘀濁相互搏結(jié)，反復(fù)日久，耗傷臟腑氣血津液，從而造成濁毒內(nèi)壅、氣滯絡(luò)阻、脾不升清、胃失和降、陰血耗傷、氣虛血郁的證機(jī)變化，而濁毒相干為致病的關(guān)鍵。

TNF－α（腫瘤壞死因子）是一種促炎癥蛋白，可致胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使血流減少，而胃黏膜血流在胃黏膜屏障的防御作用中至關(guān)重要，從而造成胃黏膜損傷[5]。適量的TNF－α可參與免疫細(xì)胞的活化炎癥反應(yīng)，具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤作用；而過(guò)量的TNF－α則增強(qiáng)微血管壁通透性，改變黏膜血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性，致微血管內(nèi)凝血，致細(xì)胞破壞，溶酶體漏出，炎性介質(zhì)釋放，使黏膜營(yíng)養(yǎng)不良[6]。本研究表明，模擬濁毒證組膽汁反流性胃炎大鼠血清TNF－α水平明顯升高，說(shuō)明濁毒的產(chǎn)生可能和血清TNF－α水平升高有關(guān)。

自由基是機(jī)體內(nèi)代謝的必然產(chǎn)物，在體內(nèi)不斷產(chǎn)生，同時(shí)又被不斷清除。一定的含量對(duì)人體有生理作用，但是產(chǎn)生過(guò)多后超出機(jī)體的清除能力，就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[7]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物，故測(cè)定MDA水平可反映氧自由基的水平。它是評(píng)估自由基對(duì)機(jī)體損害程度的重要參考指標(biāo)。過(guò)氧化物歧化酶（SOD）是自由基清除系統(tǒng)中最重要的酶類之一，在胃壁細(xì)胞內(nèi)活性很強(qiáng)。它能夠及時(shí)有效地清除體內(nèi)自由基，免除其對(duì)機(jī)體的損害作用。體內(nèi)SOD含量大小，在一定程度上反映機(jī)體清除自由基能力的大小。本實(shí)驗(yàn)表明，模擬濁毒證組膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜由于MDA水平升高和SOD水平下降，大量氧自由基對(duì)胃黏膜造成損傷，說(shuō)明濁毒的產(chǎn)生可能和胃黏膜MDA水平升高和SOD水平下降有關(guān)。

[1]柴天川，王彥剛，王紅英.濁毒型慢性膽囊炎豚鼠模型的復(fù)制[J].河北中醫(yī)，2005，22（3）：1556－1561.

[2]張靜霜，朱西杰，朱微微，等.復(fù)方蜥蜴散對(duì)慢性萎縮性胃炎模型大鼠腫瘤壞死因子TNF－α及胃黏膜病理組織學(xué)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（2）：286－288.

[3]楊牧祥，于文濤，白瑞軍，等.胃炎飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性膽汁反流性胃炎大鼠胃黏膜自由基代謝的影響[J].疑難病雜志，2009，11（11）：657－659.

[4]李佃貴，朱 峰，劉建平，等.濁毒論治探討[J].山西中醫(yī)，2008，24（11）：1－3.

[5]Appleyard CB，Mc Cafferty DM，Tigle AW，et al.TNF－αmediation of NSAID－induced gastric damage：role of leukocyte adherence[J].Am J physiol，1966，270：42－48.

[6]張靜霜，朱西杰，朱微微，等.復(fù)方蜥蜴散對(duì)慢性萎縮性胃炎模型大鼠腫瘤壞死因子TNF－α及胃黏膜病理組織學(xué)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，2l（2）：286－288.

[7]李 濤，王秀玲.氧自由基與胃腸疾病研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·消化系疾病分冊(cè)，1997，17（4）：204.