周雪 ，范志勇 ，湯煒 ，張麗萌 ，李閏婷 ，周瑜 ，崔玉東

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.大慶市第四中學）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一種重要的人獸共患病原菌[1]，常引起人類局部化膿感染，特別是醫(yī)院內(nèi)感染、器械植入感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，嚴重者可致敗血癥、膿毒癥等全身感染[2]；S.aureus也經(jīng)常引起動物各種化膿性疾病，如雞的化膿性關節(jié)炎，牛、羊的急性或慢性乳房炎，豬的流產(chǎn)、皮炎，馬屬動物的創(chuàng)傷感染、膿腫、蜂窩織炎等[3]，給人和動物的健康帶來了巨大的危害。防治S.aureus感染的傳統(tǒng)方法是抗生素療法，但由于抗生素的濫用，耐抗生素的新菌株不斷出現(xiàn)，特別是耐甲氧西林菌株的蔓延，使得單純依靠抗生素治療S.aureus引起的相關疾病越來越無效[4-6]，因此，利用疫苗防治S.aureus感染成為了全球的熱點。傳統(tǒng)的疫苗主要有全菌滅活疫苗、莢膜多糖疫苗和內(nèi)毒素疫苗等，多年的研究證實，在臨床上的免疫保護作用并不理想[7]。近年的大量研究表明，基因工程疫苗有望成為替代傳統(tǒng)疫苗的新型疫苗，基因工程疫苗中最常見的是亞單位疫苗，亞單位疫苗具有針對性強和安全性高等優(yōu)點[8-9]。實驗室對S.aureus ClfA （Clumping factor A）[10]、IsdB （Iron-surface determinant B）[11]、Rap （RNAIII-activating protein）[12]和 TraP（Target of RNAIII-activiting protein）[12]蛋白進行了大量的動物免疫研究工作，我們發(fā)現(xiàn)ClfA、IsdA、Rap、IsdB和TraP蛋白都具有良好的免疫保護作用，小鼠免疫試驗表明融合蛋白的免疫保護作用高于單個蛋白，但是融合蛋白的表達純化受到其大小的限制，不能有效的將更多的具有良好免疫保護作用的蛋白融合起來，近年來興起的表位疫苗能很好地解決這一問題，它可以在不影響有效的抗原活性位點的前提下盡量去除免疫反應性低的蛋白片段，而且可以避免與體內(nèi)抗原存在的交叉反應[9]。要進一步研究S.aureus多抗原嵌合表位疫苗，就必須對這些蛋白的抗原表位進行研究，研究制備了抗TraP蛋白McAb的雜交瘤細胞株，為研究TraP蛋白的抗原表位奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 細胞、動物和質粒

骨髓瘤細胞 SP2/0和 6～8周齡 SPF級雌性BALB/c小鼠均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；重組菌 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap、Rosetta（DE3）/pET32a（+）/gapc、Rosetta（DE3）/pQE30/isdB、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfA、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfB、BL21（DE3）/pET32a（+）/can 和 BL21（DE3）/pET32a（+）/fnbpA由黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院細胞生物學實驗室構建保存。

1.2 主要試劑

改良型RPMI-1640購自Thermo公司；胎牛血清購自GIBCO公司；蛋白質Marker購自Fermentas公司；融合劑 PEG1500、DMSO、Goat anti-mouse IgGHRP、弗氏完全佐劑 （CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）購自Sigma公司；Ni-NTA His-Band Resin購自Novagen公司；單克隆抗體免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司。

1.3 抗原制備與動物免疫

將 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap 重組菌劃線接種于含有100 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑單菌落接種于含有100 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600nm為 0.5～0.6，加入終濃度為 100 μg·mL-1的 IPTG，誘導時間為3 h。取誘導后的菌液，離心收集菌體，并用PBS清洗3次，超聲破碎，4℃12000 rpm離心30 min，收集上清。按照Ni-NTA His-Bind Resin試劑盒說明書純化蛋白，然后進行SDS-PAGE電泳，并用Gene Quant pro基因定量儀（Amersham）測其濃度。

三次免疫劑量均為100 μg TraP蛋白/只小鼠，取純化的TraP蛋白100 μg溶解于100 μL PBS中，與等體積的弗氏佐劑充分混勻，對6～8周齡健康的BALB/c雌性小鼠進行皮下和腹腔多點注射免疫，首次免疫后分別于2周和4周用同樣的方法進行第2次和第3次免疫，初免佐劑為CFA，此后免疫佐劑均為IFA，三免后10 d尾靜脈采血，用間接ELISA方法進行血清抗體效價測定，效價達到1∶10000以上可用于融合。在融合前3 d，按200 μg·只-1腹腔注射TraP蛋白加強免疫。

1.4 確立McAb ELISA檢測方法的最佳工作濃度

按段舒怡等報道的方陣滴定法進行間接ELISA[13]。以 1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800 系列倍比稀釋抗原包被ELISA板，確定抗原的最佳稀釋度；以 1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400 系列倍比稀釋BALB/c雌性小鼠的陰、陽性血清，確定血清的最佳工作濃度；加入1∶5000工作濃度的HRP-羊抗鼠IgG與之作用，加入底物TMB顯色，以2 M硫酸終止反應后測定OD450nm值。P/N≥2.1判定為陽性。

1.5 構建雜交瘤細胞株及腹水效價測定

參考《分子克隆實驗指南》第三版介紹的方法進行細胞融合與選擇性培養(yǎng)。用間接ELISA方法進行篩選，陽性細胞用有限稀釋法對其進行克隆，三次單克隆化后擴大培養(yǎng)，凍存。

選8～12周齡健康的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射無菌的IFA 0.5 mL·只-1。一周后，將培養(yǎng)的雜交瘤細胞吹打下來，2000 r·min-1離心3 min，棄上清，重懸細胞，計數(shù)備用。每只小鼠腹腔接種雜交瘤細胞1～3×106個。7～10 d 后，采集腹水。取少量腹水進行間接ELISA測定效價。

1.6 McAb特異性鑒定

1.6.1 McAb亞類鑒定

按照Southernbiotech/HRP抗體亞類試劑盒操作說明鑒定McAb的亞類。

1.6.2 交叉實驗

采用間接ELISA的方法進行交叉實驗，檢測McAb 與實驗室表達純化的 ClfA、ClfB、Can、FnbA、IsdB和GapC蛋白之間的交叉反應。

1.6.3 Western-blotting鑒定

將純化的TraP蛋白進行SDS-PAGE電泳，利用濕轉化進行電轉膜，以腹水McAb為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，DAB顯色，觀察特異蛋白條帶。同時設立SP2/0細胞注射小鼠制備的腹水作陰性對照。

2 結果

2.1 TraP蛋白表達與純化結果

收集誘導后的重組菌，超聲破碎后用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白純化系統(tǒng)對TraP蛋白進行純化，純化后測定其濃度，并進行SDS-PAGE電泳（圖1），圖中第5道可見清晰的單一條帶，為純化后的TraP蛋白，顯示高純度的抗原，其分子量為23 kD，濃度為 0.557 mg·mL-1。

圖1 TraP蛋白表達與純化的SDS-PAGE結果Fig.1 SDS-PAGE result of expressed and purified Recombinant protein TraP

2.2 確立最佳抗原工作濃度

方陣滴定實驗結果顯示，抗原1∶800稀釋，陰性血清和陽性血清1∶1600稀釋時，P/N值最大，為23.21。確定間接ELISA檢測方法的最佳工作條件為抗原 1:800 稀釋（0.070 μg/孔），血清 1∶1600 稀釋。

2.3 單克隆抗體制備及效價測定

TraP蛋白免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合后第7 d可見細胞集落，融合率約為95%，融合10 d后用建立的ELISA方法篩選，經(jīng)3次檢測和3次克隆化后，獲得11株穩(wěn)定分泌抗TraP的McAb的雜交瘤細胞，連續(xù)傳21代，細胞生長狀態(tài)良好，反復凍存、復蘇后，能保持穩(wěn)定的抗體分泌能力。

用純化的TraP蛋白作為抗原，通過間接ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水抗體效價。11株McAb 的細胞培養(yǎng)上清抗體效價在 1∶160～1∶5120 之間，而腹水抗體效價均到達1∶128000以上，明顯高于細胞培養(yǎng)上清。

2.4 McAb亞類鑒定

按照McAb亞類鑒定試劑盒操作，對11株McAb 進行了鑒定，其中 8 株 McAb（2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3、2D8）重鏈為 IgG1 型，3 株 McAb（2A7、3A1、1C4）重鏈為 IgM 型，輕鏈均為 κ 鏈（表2）。

表1 單克隆抗體亞類鑒定結果Tabel 1 The result of identifiying subtypes of McAb

2.5 McAb特異性鑒定

2.5.1 交叉實驗結果

經(jīng)間接ELISA檢測，8株IgG1型McAb分別與ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB 和 GapC 六種不同載體表達的蛋白反應，OD450nm值均小于0.330。與陰陽性對照比較，結果表明8株McAb與ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB和GapC蛋白均無交叉反應，具有良好的特異性（表2）。

表2 特異性試驗-間接ELISA結果Table 2 Specific test of McAbs by indirect-ELISA

2.5.2 Western-blotting鑒定結果

TraP蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，以腹水初步純化后的 McAb 2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3 和 2D8為一抗，DAB顯色后，在23 kD處出現(xiàn)清晰條帶，陰性對照以SP2/0腹水為一抗，結果表明8株McAb識別的是TraP蛋白的線性表位。

圖2 單克隆抗體的Western blot鑒定Fig.2 Western blot assay of McAbs with protein TraP

3 討論

1975年Koller和Milstein創(chuàng)建了雜交瘤技術并成功制備了單克隆抗體[14]，時至今日，該法在基礎研究和應用研究中依然發(fā)揮了舉足輕重的作用。與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體具有特異性強和靈敏度高的優(yōu)勢。在制備單克隆抗體的過程中，最關鍵的步驟是細胞融合，影響融合成功的因素很多，如骨髓瘤細胞的選擇，脾細胞制備以及融合劑的選擇等。實驗中所用的SP2/0細胞為不分泌抗體、對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞株，處于良好的生長狀態(tài)和在對數(shù)分裂期使用是獲得高融合率的關鍵；脾細胞制備過程應當快速、輕柔，脾中的紅細胞會降低融合率，應盡量去除；融合劑的分子量必須合適，分子量太小融合效率低，太大又極易引起細胞凝集，實驗中應用的為PEG1500，取得了滿意的效果。實驗采用間接ELISA方法進行篩選和有限稀釋法進行細胞單克隆化，操作簡單，一次可以篩選大量的樣本，并且具有較高的特異性和敏感性，能夠快速高效的獲得單克隆雜交瘤細胞株。

研究獲得了11株能夠穩(wěn)定分泌抗金黃色葡萄球菌TraP蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其中8株為IgG1型，3株為IgM型，IgM型抗體以五聚體形式作用，它是在初次免疫應答時最早出現(xiàn)的抗體，通常僅存在于血液內(nèi)，對組織液或外分泌液中的保護作用沒有多大貢獻，而且純化過程較為復雜，因此，后續(xù)的工作只對8株為IgG1型單克隆抗體進行研究。交叉試驗中，不同表達載體表達的含有His標簽的蛋白都不與McAb發(fā)生特異性反應，表明這8株單克隆抗體不是針對His標簽或者其他蛋白的，具有良好的特異性，抗體效價理想，且western-blotting結果表明這8株單克隆抗體很有可能識別的是TraP蛋白的線性表位，為進一步利用噬菌體展示技術分析TraP蛋白的抗原表位奠定了基礎。

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