李青川，高玉榮

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

在當(dāng)今的經(jīng)濟發(fā)展中，乙醇廣泛應(yīng)用于化學(xué)工業(yè)、食品、醫(yī)藥及軍事等領(lǐng)域[1]。目前,世界各國日益重視能源問題，燃料乙醇由于其可再生性，被認為是最有可能代替石油的液體燃料[2]。因此燃料乙醇的需求量迅速增加，市場潛力十分巨大。

大豆糖蜜是大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，其含糖量可達40%以上[3]，目前，大豆糖蜜主要作為飼料添加劑添加于飼料中，未能進行大規(guī)模的深加工利用。目前，在我國酒精的產(chǎn)量中，主要以玉米、谷物、薯類、糧食與經(jīng)濟作物發(fā)酵[4]。利用大豆糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，不僅有利于緩解我國糧食緊張的壓力，降低生產(chǎn)成本，而且能促進大豆?jié)饪s蛋白生產(chǎn)企業(yè)副產(chǎn)品的有效利用。

優(yōu)良的酵母菌株是決定乙醇產(chǎn)量的重要因素。為了獲得適合利用大豆糖蜜進行發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株，擬從大豆糖蜜中，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的乙醇生產(chǎn)菌株，并進行生長特性的研究，以期為以大豆糖蜜為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

大豆糖蜜：黑龍江雙河松嫩生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 增殖培養(yǎng)基：自制麥芽汁液體培養(yǎng)基，12 °Brx，自然 pH。

1.1.2.2 分離培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂2%，自然pH值，121℃滅菌20 min。

1.1.2.3 活化培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，自然pH值，121℃滅菌20 min。

1.1.2.4 TTC下層培養(yǎng)基：20%糖蜜，瓊脂2%，121℃滅菌20 min。

1.1.2.5 TTC上層培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%,瓊脂1.5%,加水加熱溶解，吸取9.5 mL加入到試管中121℃滅菌20 min，加入5%TTC濃溶液使其濃度為0.5%，混勻。

1.1.2.6 生長培養(yǎng)基：經(jīng)3 000 r·min-1離心處理10 min處理后的大豆糖蜜，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

SYQ·DMSX-280手提式壓力蒸汽消毒器；LRH-150 S恒溫恒濕培養(yǎng)箱；ZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱；752紫外可見分光光度計；分析天平（感量0.000 1 g）；全玻璃蒸餾器；水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的富集及分離

吸取1 mL大豆糖蜜液放于加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于28℃、100 r·min-1培養(yǎng)24 h。吸取1 mL含菌增殖培養(yǎng)基進行十倍梯度稀釋至1×10-6；分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TTC下層培養(yǎng)基上，28±1℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2 酵母菌的篩選

1.2.2.1 TTC平板法初篩

將融化并冷卻到45～50℃的TTC上層培養(yǎng)基，倒入菌落數(shù)量在100個左右的TTC平板上，28±1℃培養(yǎng)箱中避光保溫3 h，取顯色效果好的菌株接于YPD固體斜面培養(yǎng)基上[5]。

1.2.2.2 耐乙醇酵母菌的篩選

將顯色效果好的菌株斜面2環(huán)，接入裝有加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基中，28℃、100 r·min-1培養(yǎng)24 h。吸取9.5 mL增殖培養(yǎng)基放于試管中，放入杜氏小管并排出氣體。在無菌操作條件下加無水乙醇，使乙醇濃度（v/v）分別為 12%、14%、16%、18%和20%，接種0.5 mL菌液接種于各試管中，28℃培養(yǎng)72 h，每天時觀察產(chǎn)氣情況，選擇產(chǎn)氣快且量大的菌株作為后續(xù)試驗，并傳接于分離培養(yǎng)基中[6]。

1.2.2.3 高產(chǎn)乙醇酵母菌的篩選

取耐乙醇能力強的菌株的斜面菌種，挑取2環(huán)接入加有玻璃珠的20 mL增殖培養(yǎng)基中，28℃、100 r·min-1培養(yǎng)18 h。錐形瓶中分別裝入45 mL糖濃度為30%的生長培養(yǎng)基，接種菌懸液5 mL，在28 ℃、100 r·min-1發(fā)酵 24 h 后，靜置發(fā)酵至 72 h，測定發(fā)酵液中的乙醇含量。

1.2.3 篩選菌株生長條件研究

1.2.3.1 最適生長糖濃度的測定

取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株，在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后，將 5%（v/v）種子液分別接入糖濃度為2%、4%、6%、8%、10%的生長培養(yǎng)基中，裝液量為 40 mL/250 mL，28 ℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后，測定其生物量。

1.2.3.2 最佳接種量的測定

取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株，在增殖培養(yǎng)基經(jīng) 28℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后，分別將1%、2%、3%、4%、5%（v/v）的種子液接入到 1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長培養(yǎng)基中，裝液量為40 mL/250 mL，28 ℃，100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后，測定其生物量。

1.2.3.3 最適生長溫度的測定

取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株，在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h后，將 5%（v/v）種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長培養(yǎng)基中，裝液量為 40 mL/250 mL，分別在 24、26、28、30、32℃，100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后，測定其生物量。

1.2.3.4 最適生長pH值的測定

取篩選出來的高產(chǎn)乙醇的菌株，在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28 ℃、100 r·min-1活化培養(yǎng) 18 h 后，將 5%（v/v）種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長培養(yǎng)基中，裝液量為40 mL/250 mL，生長培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，28 ℃、100 r·min-1振蕩培養(yǎng)18 h后，測定其生物量。

1.2.3.5 轉(zhuǎn)速對酵母菌生長的影響

在增殖培養(yǎng)基經(jīng)28℃、100 r·min-1活化培養(yǎng)18 h后，將5%（v/v）種子液接入1.2.3.1中所確定的最佳糖濃度的生長培養(yǎng)基中，裝液量為40 mL/250 mL，28 ℃下，分別在 80、100、120、140、160 r·min-1的轉(zhuǎn)速條件振蕩培養(yǎng)18 h后，測定其生物量。

1.2.3.6 生長曲線的測定

將最適接種量的種子增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)液接入到最適種子生長培養(yǎng)基中，最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，每隔2 h測定其生物量[7]。

1.3 檢測方法

乙醇含量的測定方法：蒸餾法[8]。

糖含量的測定方法：用手持式糖度計測定。

生物量的測定方法：采用比濁法,將發(fā)酵液混勻后稀釋一定倍數(shù),測定其在600 nm 的吸光度（OD600）[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離篩選

從大豆糖蜜中共分離得到12 個平板1 380 株菌供一級篩選。

2.1.1 TTC 平板法初篩

經(jīng)避光保溫培養(yǎng)后，觀察比較TTC 平板中各菌株的顏色深淺，顏色比較深的菌株說明其呼吸酶活力強，產(chǎn)酒精能力較強，共挑出具有典型酵母菌菌落特征顯色較深的的菌株156 株，進行耐乙醇能力的測定。

2.1.2 耐乙醇酵母菌的篩選

從TTC 平板法初篩得到的菌株中篩選耐乙醇能力強的菌株。通過觀察菌株在含不同濃度乙醇的培養(yǎng)基中發(fā)酵程度的強弱，即在杜氏小管中氣泡產(chǎn)生的快慢與多少，可知其對乙醇耐受能力。到72 h 時觀察到，各菌株的在20%的乙醇濃度的發(fā)酵管里菌株B1、B2、B3、B5、B6、T1、T2、T4、T5、T6、P11、P14 仍 有著不同的產(chǎn)氣情況，說明這些菌株比其它菌株具有更強的乙醇耐受能力，其產(chǎn)生乙醇的能力也可能會更大。

2.1.3 高產(chǎn)乙醇酵母菌的篩選

對耐乙醇能力強的菌進行產(chǎn)乙醇能力的測定。由表1 可看出，P14 的乙醇濃度最高，達到9.07%（v/v）。

表1 乙醇含量測定結(jié)果Table 1 The results of the ethanol content determination

2.2 P14 生長條件研究

2.2.1 最適生長糖濃度的測定

酵母菌利用大豆糖蜜中的糖作為生長所需的養(yǎng)分，糖濃度過低會導(dǎo)致酵母菌因養(yǎng)分不充足而生長緩慢，糖濃度過高又會使培養(yǎng)基的滲透壓增大，從而抑制酵母菌的增殖。由圖1 可看出，大豆糖蜜的糖濃度對P14 的生長影響顯著，當(dāng)糖濃度達到12%時P14 生長最旺盛，生物量最大。因此，確定大豆糖蜜糖濃度為12%作為P14 的最適生長糖濃度。

2.2.2 最佳接種量的測定

種子接種量的大小對酵母菌的生長影響顯著。由圖2 可看出，接入不同量的種子液后，經(jīng)過18 h 的培養(yǎng)，不同接種量的培養(yǎng)液呈現(xiàn)了不同的OD600 值，接種量為1%～4%時，OD600 值隨接種量的增加而增加，當(dāng)接種量達到5%時，OD600 值則出現(xiàn)了下降的趨勢。因此，P14 的最適接種量為4%。

2.2.3 最適生長溫度的測定

溫度對菌種生長影響顯著，低溫生長速度慢，高溫菌種容易衰老死亡。由圖3 可看出，在不同溫度的條件下經(jīng)過 18 h、100 r ·min-1 的培養(yǎng)，26 ℃時培養(yǎng)液的OD600 值出現(xiàn)了最高值。因此，選26℃作為P14的最佳生長溫度。

2.2.4 最適生長pH 值的測定

酵母菌在其生長過程中，生長環(huán)境的pH 值過高或過低都會影響酵母菌細胞膜表面基團的解離，從而進一步影響到對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和自身代謝物的分泌。由圖4 可看出，在不同pH 值的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著pH 值從4.5 增加到7.0 時，在6.0 處出現(xiàn)了最高值，但OD600 值的趨勢線比較平緩，pH 值對其影響不顯著。因此，選取6.0 作為P14 的最適生長pH。這與培養(yǎng)基的自然pH 值接近。

2.2.5 最佳生長轉(zhuǎn)速的測定

轉(zhuǎn)速是影響到培養(yǎng)基中的可溶性氧含量的另一個因素，因此培養(yǎng)過程中合適的轉(zhuǎn)速可為酵母菌的快速生長補充充足的氧分。由圖5 可見，140 r ·min-1時OD600 值最大，因此選取140 r ·min-1 作為P14 的搖瓶轉(zhuǎn)速。

2.2.6 生長曲線的測定

在進行發(fā)酵試驗時，應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期的菌體，在此階段細胞生長旺盛，代謝活性強，繁殖快，個體形態(tài)、化學(xué)組成、生理特性等均較為穩(wěn)定、一致。由圖6 可看出，菌株P(guān)14 沒有生長的延滯期，從培養(yǎng)的一開始便進入對數(shù)生長期，當(dāng)培養(yǎng)到16 h 后，OD600 值基本趨于穩(wěn)定；當(dāng)培養(yǎng)到24 h 時，其生物量開始減少，說明從22 h 開始進入了衰亡期。由P14 的生長特性可知，在糖濃度12%的大豆糖蜜培養(yǎng)基中，控制pH 值6.0，發(fā)酵溫度26℃，轉(zhuǎn)速140 r ·min-1，培養(yǎng)16 h 可獲得最佳的種子。

3 結(jié)論

3.1 采用TTC 平板法、乙醇耐性測定以及產(chǎn)乙醇性能三級篩選，從大豆糖蜜中分離的1 380 株野生菌中，篩選到1 株可耐受20%（v/v）乙醇、初始發(fā)酵的乙醇濃度達9.07%的菌株P(guān)14?？蔀榇蠖固敲鄣陌l(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供優(yōu)良的菌種。

3.2 研究確定了該菌的最佳生長條件為糖濃度12%，接種量4%，生長溫度26℃，pH 6.0，轉(zhuǎn)速140 r ·min-1。在此條件下，培養(yǎng)16 h 后獲得最佳的種子培養(yǎng)液。

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