田文嘉 杜洪震 卞曉翠 李開龍

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100005)

胰腺癌是消化道系統(tǒng)預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔1，2〕?，F(xiàn)有研究表明，在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中有多個(gè)基因突變，包括12個(gè)關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)途徑，如TGF-β信號途徑、鳥嘌呤三磷酸酶(GTPase)依賴的信號途徑、Wnt/Notch信號途徑和JNK信號途徑等〔3〕，說明胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多基因、多信號途徑參與的復(fù)雜的生物過程。因此，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證與胰腺癌轉(zhuǎn)移有因果關(guān)系的基因和信號途徑對胰腺癌的診斷和治療有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合全基因組基因突變技術(shù)和小鼠功能篩選，利用多克隆同步篩選和驗(yàn)證胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群，從而得到與胰腺癌轉(zhuǎn)移有高度關(guān)聯(lián)的基因。

1 材料與方法

1.1 胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群篩選前期基礎(chǔ) 本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)采用全基因組隨機(jī)基因敲除技術(shù)平臺 (RHKO)在人類胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1建立了全基因組隨機(jī)突變文庫。RHKO的原理是通過能在真核細(xì)胞中高效整合的piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建基因搜尋載體 (Gene Search Vector，GSV)，并將其隨機(jī)插入基因組中，造成全基因組范圍內(nèi)的隨機(jī)基因突變。在轉(zhuǎn)錄激活因子tTA的作用下，GSV中的TRE反應(yīng)元件被激活，進(jìn)而啟動附近基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄激活子tTA與TRE的結(jié)合還受到強(qiáng)力霉素 (Doxycycline，DOX)的調(diào)控，通過添加或者不添加DOX能夠?qū)崿F(xiàn)人為控制tTA是否激活TRE而啟動附近基因的轉(zhuǎn)錄。此外，GSV中還包含新霉素抗性基因，使轉(zhuǎn)入GSV的真核細(xì)胞可以利用G418篩選陽性克隆。利用這一技術(shù)建立了一個(gè)含約110萬隨機(jī)基因的突變文庫，進(jìn)而通過裸鼠轉(zhuǎn)移模型篩選具有肺轉(zhuǎn)移特性的AsPC-1細(xì)胞亞群，初步篩選和原代培養(yǎng)得到45個(gè)肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞克隆，利用Splinkette PCR的方法從具有高轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞株中克隆GSV插入位點(diǎn)，從中得到16個(gè)候選基因。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)采用HyClone公司的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10%的胎牛血清和100 U/ml的青霉素以及0.1 mg/ml鏈霉素。45個(gè)高轉(zhuǎn)移的AsPC-1細(xì)胞克隆M1，M2，M3……M45分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期，各取1×105個(gè)細(xì)胞混合至15 cm的培養(yǎng)皿中，放于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，胰酶消化、離心、收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，離心后重懸并計(jì)數(shù)細(xì)胞，1×106個(gè)細(xì)胞/只，采用尾靜脈注射的方式注射到兩組裸鼠體內(nèi)。

1.3 動物 SPF級別4～6周齡雌性裸鼠(BALB/C nu/nu)，使用前裸鼠適應(yīng)動物房的環(huán)境1 w，減少外界環(huán)境對實(shí)驗(yàn)的影響。實(shí)驗(yàn)動物分為加入強(qiáng)力霉素(+Dox)和不加強(qiáng)力霉素(-Dox)兩組，每組8只。+Dox組動物的飲水中加入強(qiáng)力霉素(終濃度為200μg/ml)，由于強(qiáng)力霉素在光照條件下容易分解，所以+Dox組動物的飲水器用錫箔紙包裹以遮蔽光線。

1.4 原代培養(yǎng) 一旦裸鼠出現(xiàn)病態(tài)體征，如:行動緩慢、呼吸異常、體形消瘦、神情低迷、反應(yīng)性差等，立即處死，碘酒消毒，在通風(fēng)櫥內(nèi)取出肺臟(圖1)。在玻璃皿內(nèi)用PBS清洗數(shù)次以盡可能洗去血漬。用手術(shù)刀將肺組織切碎，用含有600μg/ml G418(CALBIO-CHEM)的DMEM培養(yǎng)基懸浮碎塊至20 ml離心管，1 200 r/min離心5 min后，棄上清，加入15 ml紅細(xì)胞裂解液，重懸組織碎塊，靜置裂解紅細(xì)胞10 min。1 200 r/min離心5 min，棄上清，用PBS清洗并1 200 r/min離心5 min，棄去上清后用培養(yǎng)基重懸組織碎塊，并將其轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中。第二天更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的懸浮組織碎塊，并加入新鮮培養(yǎng)基。5 d后，加入G418篩選轉(zhuǎn)移到肺組織的AsPC-1細(xì)胞。3～5 d換1次液并加入G418，大約2 w后，培養(yǎng)皿內(nèi)可見散在的AsPC-1細(xì)胞克隆，消化后擴(kuò)大培養(yǎng)。每只裸鼠的肺臟用兩個(gè)10 cm的培養(yǎng)皿分別培養(yǎng)，一個(gè)培養(yǎng)皿用于細(xì)胞凍存，另一個(gè)培養(yǎng)皿用于基因組DNA的提取。細(xì)胞培養(yǎng)于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中。

1.5 提取基因組DNA 待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，PBS漂洗2次，根據(jù)威格拉斯基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取基因組DNA后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度。

1.6 基因組PCR 根據(jù)高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株中GSV插入位點(diǎn)的測序結(jié)果和GSV的序列結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)基因的引物。引物序列設(shè)計(jì)如下:SQSTM1:5'CCT GAA GCT CTA CAA ACA AGG AAT ATT TCA 3'，PB:5'TTT TACGCA TGA TTA TCT TTA ACGTAC GTC 3'，反應(yīng)產(chǎn)物長度SQSTM1為525 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增DNA片段。

2 結(jié)果

前期大規(guī)模篩選得到45個(gè)AsPC-1人胰腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞群，為進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證具有肺轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞亞群，從每個(gè)細(xì)胞亞群各取105細(xì)胞混合形成混合細(xì)胞亞群庫?；旌蠋旒?xì)胞分別尾靜脈接種兩組小鼠:一組飲用水中加強(qiáng)力霉素，另一組飲用水中不加強(qiáng)力霉素。50～73 d后，分別取每只小鼠肺進(jìn)行原代培養(yǎng)得到具有肺轉(zhuǎn)移能力的胰腺癌細(xì)胞亞群(圖1，圖2)，共得到16個(gè)細(xì)胞亞群，每組得到8個(gè)細(xì)胞亞群。體內(nèi)多克隆篩選和原代培養(yǎng)，加強(qiáng)力霉素組培養(yǎng)出較多的細(xì)胞克隆，而不加強(qiáng)力霉素組培養(yǎng)出的細(xì)胞克隆數(shù)較少。利用16對特異基因定位DNA引物PCR分析了16個(gè)細(xì)胞亞群。PCR分析結(jié)果顯示+Dox組，肺轉(zhuǎn)移原代培養(yǎng)有3只小鼠檢測到 SQSTM1基因細(xì)胞亞群 (37.5%)，而-Dox組有6只小鼠檢測到SQSTM1基因細(xì)胞亞群 (75.0%，圖3)。PCR分析SEMA4B，UBE2K和GNA13基因在16只小鼠都為陰性。檢測表明，強(qiáng)力霉素介導(dǎo)的SQSTM1基因表達(dá)能導(dǎo)致不同的胰腺癌肺轉(zhuǎn)移能力。

圖1 +Dox組和－Dox組裸鼠的生存曲線

圖2 +Dox組和－Dox組裸鼠的肺臟

圖3 +Dox組和－Dox組裸鼠中SQSTM1表達(dá)情況

3 討論

目前，胰腺癌的臨床治療手段主要是早期手術(shù)切除加術(shù)后放、化療，針對胰腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移特性的多種藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療，在一定程度上改善了胰腺癌病人的生存質(zhì)量和預(yù)后，但胰腺癌的死亡率依然沒有明顯改善。腫瘤轉(zhuǎn)移是胰腺癌病人的主要死亡原因，因此，找出控制胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因就顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)選用分化好、惡性程度相對低的AsPC-1人胰腺癌細(xì)胞系為研究對象，采用全基因組隨機(jī)基因敲除技術(shù)平臺〔4〕的方法，尋找將低轉(zhuǎn)移性AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咿D(zhuǎn)移細(xì)胞的關(guān)鍵基因，以期為臨床上早期診斷、早期治療提供新的作用靶點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)室前期工作篩選得到的16個(gè)候選基因的基礎(chǔ)上，本研究利用裸鼠體內(nèi)篩選和基因組 PCR的方法，篩選出SQSTM1是在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵基因之一。多項(xiàng)研究表明SQSTM1具有調(diào)控細(xì)胞多種功能的作用。SQSTM1能夠通過抑制有絲分裂信號傳導(dǎo)而阻礙脂肪細(xì)胞的分化，能夠通過控制破骨細(xì)胞的生成而調(diào)節(jié)骨的重塑〔4，5〕。SQSTM1能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子受體內(nèi)部化、蛋白定位以及通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑而在Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起一定的作用〔6，7〕。SQSTM1還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞耗氧量以及下調(diào)胞外調(diào)控激酶(ERK-1/2)磷酸化的作用〔5〕。然而，SQSTM1在胰腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中的詳細(xì)機(jī)制，以及這個(gè)基因在其他腫瘤轉(zhuǎn)移中是否也起到相同的關(guān)鍵作用，需要進(jìn)一步的研究。

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