徐建蘭

合歡花 Albizia julibrissin Durazz.為常用中藥，具有解郁安神之功效，用于治療心神不安、憂郁失眠。2005年版《中國(guó)藥典(一部)》合歡花項(xiàng)下收載合歡花藥用部位僅為干燥的花序[1]，但根據(jù)多批樣品收集情況和各地區(qū)實(shí)際使用情況調(diào)查，合歡的干燥花蕾在全國(guó)多個(gè)省份也被作為合歡花使用，習(xí)稱為“合歡米”，《中華本草》《中藥大辭典》《全國(guó)中草藥匯編》中合歡花藥用部位均為花序或花蕾。合歡花主要含有黃酮類成分，且以槲皮苷的含量較高，槲皮苷具有止血、抗毛細(xì)血管脆性及抗病毒等作用，藥理活性明顯[2－3]。筆者采用高效液相色譜法，測(cè)定了合歡花和合歡米中槲皮苷的含量，通過比較兩者主要成分槲皮苷的含量差異，欲從有效成分的角度說明其兩個(gè)藥用部位(花序或花蕾)均作為合歡花使用有一定的合理性，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

1 儀器與試藥

HP1100型液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1322A脫氣機(jī)，G1314A紫外可見檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，HP化學(xué)工作站);島津UV－260型紫外可見分光光度計(jì)。合歡花15批(編號(hào)01－15)，購(gòu)于各地中藥飲片廠或藥店，由浙江省食品藥品檢驗(yàn)所郭增喜老師鑒定;槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)為11538－200302，供含量測(cè)定用，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供);乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent Extend－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈 －0.1% 磷酸溶液(25 ∶75);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):256 nm;進(jìn)樣量:5μL。在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果表明，理論板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，見圖1。

2.2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.25 g，同時(shí)另取本品粉末測(cè)定水分[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅨH第一法]，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放至室溫，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的槲皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1 mL中含60μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:分別精密量取槲皮苷對(duì)照品溶液(57.6μg/mL)1，3，8，13，20，25 μL 注入液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、槲皮苷進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程 Y=2.764 12X－4.524 28，r=1.000 0(n=6)。結(jié) 果 表 明 ，槲 皮 苷 進(jìn) 樣 量 在 0.057 6 ～1.440μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液5μL，按以上色譜條件，分別重復(fù)進(jìn)樣6次。測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一合歡花藥材6份，依法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液5μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算槲皮苷含量。結(jié)果槲皮苷的平均含量為 8.5 mg/g，RSD=0.9%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取供試品溶液，按擬訂的色譜條件，分別于 0，4，7，15，21，27 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定槲皮苷的含量。結(jié)果的 RSD 為0.4%，表明供試品溶液在27 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的同一批樣品0.125 g，精密稱定，精密加入一定量的槲皮苷對(duì)照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法操作，平行操作9份溶液，按擬訂的色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 槲皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

按上述測(cè)定方法對(duì)15批合歡花樣品進(jìn)行測(cè)定，并以外標(biāo)一點(diǎn)法分別計(jì)算槲皮苷的含量(以干燥品計(jì))。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=15)

3 討論

供試品溶液制備中，筆者考察了回流、超聲兩種提取方法，結(jié)果表明采用回流提取效率較高。此外，通過對(duì)溶劑種類(甲醇、乙醇、50%乙醇)、超聲時(shí)間、溶劑用量等因素進(jìn)行考察，最后確定以25 mL 50%乙醇回流提取30 min為宜，該方法操作簡(jiǎn)便易行。

本試驗(yàn)中，曾結(jié)合槲皮苷的化學(xué)性質(zhì)，比較了甲醇－磷酸溶液和乙腈－磷酸2種流動(dòng)相，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈－磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫分離度較好;同時(shí)比較了0.05%磷酸、0.1%磷酸、0.2%磷酸3種緩沖液，不同酸度對(duì)3者的含量影響未見顯著性差異;比較了Ultimate XB－C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，Kromasil KR100－5 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)和 Agilent Extend－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)4種色譜柱，調(diào)整流動(dòng)相比例后均能良好分離槲皮苷，且對(duì)其含量影響未見顯著性差異。

為了選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，曾采用島津UV－260型紫外可見分光光度計(jì)對(duì)槲皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行了掃描，其在256 nm和355 nm波長(zhǎng)處有2個(gè)最大吸收峰，綜合考慮檢測(cè)靈敏度和樣品中雜質(zhì)的干擾情況，為使峰面積適宜，且雜質(zhì)干擾較少，故最終選擇256 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

從測(cè)定結(jié)果看，合歡花中槲皮苷的含量范圍為0.3%～2.4%，平均含量為1.4%。合歡米中槲皮苷的含量范圍為0.3% ～1.9%，平均含量為1.4%。由此可見，合歡花和合歡米中槲皮苷的含量非常接近。此外，筆者比較了兩者的薄層色譜圖，圖譜非常相似，這說明了其兩個(gè)藥用部位花序或花蕾都作為合歡花使用有一定的合理性。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:218.

[2]李作平，郜 嵩，郝存書.合歡花化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2000，25(2):103 －104.

[3]俞建平，馬臨科，鄭建寶.HPLC測(cè)定合歡花中槲皮苷的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(6):539 －540.