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達(dá)英-35對(duì)PCO模型大鼠中卵巢組織cx43表達(dá)的影響

2012-06-08 11:52戴碎平王永紅
中國(guó)醫(yī)藥指南 2012年17期
關(guān)鍵詞:達(dá)英顆粒細(xì)胞卵泡

戴碎平 王永紅

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科,山西 太原 030001)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種以高雄激素血癥,胰島素抵抗,稀發(fā)排卵,和卵巢多囊樣改變的在育齡婦女中比較常見的臨床綜合征。發(fā)病率在育齡期婦女中為5%~10%。持續(xù)性無排卵,不孕,雄激素過多和胰島素抵抗是其重要特征,是生育期婦女月經(jīng)紊亂最常見的原因,其病因至今尚未闡明。連紅梅等[1-2]研究表明cx43在多囊卵巢大鼠卵巢中有表達(dá)。我們前期研究證實(shí),來曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢模型大鼠是成功的,可以降低多囊卵巢模型大鼠的高雄激素血癥。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討達(dá)英-35在多囊卵巢模型大鼠卵巢組織cx43的表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡SD雌性大鼠,體質(zhì)量約150g,清潔級(jí)別:清潔級(jí),河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK (冀)2008-1-003,合格證編號(hào)1109112。

1.2 藥物

來曲唑:購(gòu)買于江蘇恒瑞醫(yī)藥公司,化學(xué)式:1-[雙(4-氰基苯基)甲基]-1,2,4-三氮唑),生產(chǎn)批號(hào)是H19991001;達(dá)英-35:購(gòu)買于拜耳醫(yī)藥公司,批號(hào)201000003;睪酮測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法):產(chǎn)品編號(hào):07207660(110782)。黃體生成素測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法):產(chǎn)品編號(hào)0175629 (110752);卵泡刺激素測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法):產(chǎn)品編號(hào)04912924(110755);生產(chǎn)廠家:SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC;冰王脫毛膏-上海冰王生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 PCO大鼠模型的建立及分組

應(yīng)用Kafali[3]造模法建立動(dòng)物模型,6周齡SD雌性大鼠36只,選至少有4d的規(guī)律動(dòng)情周期,完全隨機(jī)分為3組,即正常對(duì)照組、PCOS模型組和達(dá)英-35組,每組均為12只。每只大鼠均給以顆粒性鼠料和水,光照12h/d,每日取陰道分泌物,采用瑞士染色,監(jiān)測(cè)動(dòng)情周期。正常對(duì)照組用灌胃針灌服1%羧甲基纖維素(CMC),其余各組均灌胃服用來曲唑1mg/(kg·d)溶于1%CMC中,連續(xù)灌服21d之后,各組行剪尾采血,檢測(cè)血清FSH、LH、T、水平符合PCOS大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,其中模型組和達(dá)英-35組有兩只由于操作不當(dāng)死亡2只。剩余34只。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

達(dá)英-35(炔雌醇環(huán)丙孕酮)組為自9周齡起,按人與大鼠公斤體質(zhì)量折算系數(shù)給藥,將藥物溶于1% CMC(1mL/100g)給藥,1次/d,連續(xù)3周;同時(shí)給予正常對(duì)照組和模型組大鼠同體積1% CMC (1mL/100g),1次/d,連續(xù)21d。到12周齡整時(shí),禁飲食12h,應(yīng)用6%水合氯醛(1mL/100g)行腹腔內(nèi)麻醉,心臟取血5mL,3000r/min離心,10min分離血清,-20℃保存;取出一側(cè)卵巢后置于福爾馬林中固定3d。另一側(cè)卵巢放于-70℃凍存?zhèn)溆米鱓estern blotting。

1.5 血清性激素測(cè)定

應(yīng)用化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定睪酮,促卵泡激素、促黃體生成激素、以觀察內(nèi)分泌改變。試劑盒由SIEMNS HEALTHCARE DIANOSTICS INC公司提供,質(zhì)控符合要求。

1.6 石蠟包埋切片

用石蠟包埋卵巢組織,以4μm厚度連續(xù)切片四次。石蠟塊的制備的步驟如下:首先,將卵巢組織固定24h,從固定液中取出卵巢組織,修剪脂肪組織,最大限度的暴露卵巢組織,放入小銅盒入用來水沖洗12h,放入70%酒精過夜。其次,酒精脫水由低濃度到高濃度:組織放入70%酒精1h→80%酒精1h→90%酒精1h→95%酒精Ⅰ1h→95%酒精Ⅱ1h→100%酒精Ⅰ30min→100%酒精Ⅱ30min→酒精∶二甲苯(1∶1)30min。再次,分別放入二甲苯Ⅰ1h透明→二甲苯Ⅱ30min透明。最后,蠟缸Ⅰ浸蠟1h后,放入蠟缸Ⅱ浸蠟1h,再放入蠟缸Ⅲ浸蠟1h。

1.7 免疫組織化學(xué)染色法

采用免疫組織化學(xué)染色的方法,觀察卵巢組織中cx43的表達(dá),cx43一抗為兔抗鼠多克隆抗體,一抗稀釋比例為1∶50-200由美國(guó)bioworld公司提供。封閉液:5%BSA 3mL,用于組織切片的封閉。二抗:聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。圖像灰度值分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值測(cè)定。免疫組化染色步驟:①石蠟切片脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4)沖洗3次,每次3min(3×3′)。②根據(jù)每一種抗體的要求,對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。③如果有必要,每張切片加1滴(試劑A)室溫下孵育10min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS(pH7.4),每2min,沖洗3次。④除去PBS液,每張切片加1滴或50μL的第一抗體,4℃過夜,PBS(pH7.4),每2min,沖洗3次。⑤滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG,37度孵育30min。⑥D(zhuǎn)AB顯色。⑦蘇木精輕度復(fù)染,脫水,透明,封片,觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PCOS動(dòng)物模型

2.1.1 動(dòng)情周期的變化:陰道涂片并行瑞氏染色后,可見模型組在應(yīng)用來曲唑21d后動(dòng)情周期失去規(guī)律性變化,提示無排卵。對(duì)照組仍保持規(guī)律的動(dòng)情周期變化。

2.1.2 卵巢組織學(xué)改變:HE染色鏡檢可見模型組膜細(xì)胞層增厚;有較多早期發(fā)育的小卵泡和閉鎖卵泡;囊狀擴(kuò)張卵泡明顯增加。顆粒細(xì)胞層減少至2~3層,卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失,黃體數(shù)量明顯下降且伴有不完全的黃素化,間質(zhì)細(xì)胞明顯增生,未見排卵前卵泡及排卵跡象。染色鏡檢結(jié)果見圖1。

2.1.3 與正常對(duì)照組比較:模型組大鼠血清LH、T、FSH水平明顯升高(P<0.05),其余兩組性激素水平差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 染色鏡檢結(jié)果

2.1.4 與模型組比較:達(dá)英-35組、正常對(duì)照組大鼠血清LH、T、FSH水平明顯降低(P<0.05)。

2.1.5 與達(dá)英-35組比較:正常對(duì)照組、大鼠血清性激素?zé)o顯著性差異(P>0.05)。見表1

表1 藥物干預(yù)后各組大鼠性激素水平的比較

2.1.6 cx43在卵巢組織中的表達(dá):光鏡下可見cx43主要在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá),在模型組表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。達(dá)英-35組表達(dá)水平顯著高于模型組組(P<0.05)。見表2。

表2 三組Cx43表達(dá)水平灰度值比較(±s)

表2 三組Cx43表達(dá)水平灰度值比較(±s)

注:模型組與正常對(duì)照組比較:P<0.05;與達(dá)英-35組與正常對(duì)照組比較:P>0.05

組別 n cx43正常對(duì)照組 12 149.590± 9.25 PCO模型組 11 98.1945± 6.51達(dá)英-35組 11 143.794±9.81 F 65.842 P 0.000

3 討 論

多囊卵巢綜合征是育齡婦女中最常見的內(nèi)分泌紊亂的一種臨床綜合征。發(fā)病機(jī)制包括內(nèi)容廣泛,包括神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝系統(tǒng)和卵巢局部的調(diào)控因素。其病因至今尚未闡明,成為目前婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域內(nèi)最復(fù)雜的研究熱點(diǎn)。我們前期研究[3]已經(jīng)證實(shí)了來曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢模型大鼠是成功的,本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討達(dá)英-35對(duì)多囊卵巢模型大鼠卵巢組織cx43的表達(dá)的影響。

3.1 cx43與PCO模型大鼠卵巢組織中的表達(dá)水平及意義

cx43是卵巢組織間隙連接中表達(dá)最多的連接蛋白,由基因Gjal編碼cx43蛋白。連接蛋白是間隙連接的基本結(jié)構(gòu)單位和功能基礎(chǔ)。有兩個(gè)基因位點(diǎn)位于人類卵巢組織中:定位于6號(hào)染色體上是功能基因,定位于5號(hào)染色體上是假基因。編碼人類cx43的基因位于6q22.3,全長(zhǎng)約3.0kb[4]。cx基因家族是保守的,不同的cx具有共同的結(jié)構(gòu)特征。cx43分子質(zhì)量為43kD,其蛋白質(zhì)肽鏈由382個(gè)氨基酸構(gòu)成,其中1~242位氨基酸構(gòu)成管道部分,243~382位構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)尾部[5]。cx43主要表達(dá)在成熟卵泡卵丘上的顆粒細(xì)胞間。Gershon等[6]研究顯示cx43的下調(diào)會(huì)影響卵子產(chǎn)生,卵泡的發(fā)育,排卵功能,導(dǎo)致排卵障礙,影響早期胚胎的發(fā)育。Carabatsos等[7]研究表明,cx43影響卵泡發(fā)育可能有以下幾個(gè)方面:它促進(jìn)正常卵泡的發(fā)育,同時(shí)使得顆粒細(xì)胞能夠增多分層和正常增殖。在選擇卵泡和促進(jìn)卵泡凋亡方面發(fā)揮有益作用。在排卵、黃體形成、分化和退化中也發(fā)揮有利作用。在卵巢卵泡生理過程中發(fā)揮也重要作用。Gilchrist等[8]在研究中觀察到,細(xì)胞間縫隙連接GJC在減數(shù)分裂中起重要作用:如促進(jìn)卵母細(xì)胞新陳代謝、卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟及卵母細(xì)胞發(fā)育。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比較,在模型組中卵巢顆粒細(xì)胞中cx43的表達(dá)水平降低,cx43表達(dá)降低是PCOS發(fā)生發(fā)展的一個(gè)病理基礎(chǔ)。在卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)的cx43水平異常下降,以自分泌或旁分泌的形式作用于鄰近顆粒細(xì)胞,也可以作用于鄰近卵泡細(xì)胞和周圍原始卵泡的形成,導(dǎo)致其激素分泌活動(dòng)水平的異常變化,這可能是形成了PCOS的明顯的高雄激素血癥和卵巢呈多囊性改變等重要基礎(chǔ)。

3.2 達(dá)英-35組對(duì)多囊卵巢模型大鼠卵巢組織中cx43表達(dá)的影響

達(dá)英-35不僅可以逆轉(zhuǎn)PCOS模型大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn),進(jìn)一步從細(xì)胞因子水平探討可能通過達(dá)英-35恢復(fù)排卵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,達(dá)英-35組具有升高cx43水平、改善多囊卵巢征象、恢復(fù)排卵的作用。本實(shí)驗(yàn)研究通過觀察達(dá)英-35對(duì)多囊卵巢模型大鼠的卵巢組織中cx43的表達(dá)情況,揭示達(dá)英-35對(duì)改善多囊卵巢模型大鼠的卵巢結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著作用。經(jīng)達(dá)英-35組治療后,大鼠卵巢組織中cx43增多。由此可見,達(dá)英-35組可以改善高雄激素血癥,是各種激素和因子相互促進(jìn)和制約,調(diào)節(jié)下丘腦一垂體一卵巢軸的功能得以恢復(fù),使卵巢內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變,卵巢的局部調(diào)控恢復(fù)正常,有效的改善PCOS卵泡發(fā)育和成熟障礙,顆粒細(xì)胞增殖和分層障礙,卵母細(xì)胞發(fā)育不成熟或者缺失,稀發(fā)排卵。cx43在正常卵巢組織廣泛表達(dá)而又被廣泛研究的連接蛋白,深入研究與之相關(guān)的蛋白,更有利于我們深刻地闡明該分子的功能,也有助于理解因cx43調(diào)控導(dǎo)常而引起的一些相關(guān)疾病分子機(jī)制,也為我們今后探索新藥物提供了理論依據(jù)。

[1] 連紅梅,賈莉婷,張展.間隙連接蛋白Cx43和Cx37在多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)婦幼保健,2008,28(34):4622-4623.

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