聞治國(guó) 侯水生謝 明 黃 葦 喻俊英

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

在填鴨生產(chǎn)中，為了達(dá)到快速沉積脂肪的目的，鴨子在短期內(nèi)被人工強(qiáng)制填飼大量以玉米為主的高能飼料。其主要原因是碳水化合物進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，通過(guò)磷酸戊糖和糖酵解等途徑轉(zhuǎn)化為甘油三酯(triglycerides，TG)，最終形成脂肪組織內(nèi)的脂肪沉積［1］。北京鴨在填飼大量富含碳水化合物飼糧的刺激下，胰臟發(fā)育加速，胰淀粉酶活性也增加，但填飼后胰淀粉酶的活性增加與填飼量的增加不成比例，有部分淀粉未能充分消化而排出體外［2］。同時(shí)，玉米細(xì)胞壁中大量抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在也影響了蛋白質(zhì)和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收［3］，而生產(chǎn)中過(guò)量或過(guò)少填飼必然會(huì)造成飼料消化率低、脂肪沉積差和飼養(yǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究最適填飼量、血清脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)與填飼量的關(guān)系以及填飼?shū)喐闻K組織學(xué)特點(diǎn)，來(lái)探究不同填飼量對(duì)北京鴨生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)以及肝臟組織學(xué)的影響，以期為填鴨生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)選用96只35日齡健康、體重相近的雄性北京鴨(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所選育)，1～34日齡飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)期填飼試驗(yàn)飼糧(玉米-豆粕型飼糧)，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，試?guó)喿杂娠嬎?，填飼期? d。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet(air-dry basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)設(shè)8個(gè)組(對(duì)照組、Ⅰ～Ⅶ組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只鴨。對(duì)照組試?guó)喿杂刹墒?，平均日采食量?259.55±18.59)g;整個(gè)試驗(yàn)期填飼組填飼量不同，第1天和第2天為預(yù)填飼期，第3天到第7天為正式填飼期，每只北京鴨每天填飼量見(jiàn)表2。飼糧與水按1∶1.2混合均勻，每天分4次(06:00、12:00、18:00和 23:00)用機(jī)械填飼。

試?guó)啿捎镁W(wǎng)上平養(yǎng)，每個(gè)重復(fù)單圈飼養(yǎng)，自由飲水。填飼期鴨舍溫度為22～25℃，濕度為60% ～72%，采用人工補(bǔ)光制度，24 h光照，其他按常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，以重復(fù)為單位記錄空腹鴨體重，計(jì)算各組平均日增重和料重比。

1.3.2 血清生化指標(biāo)

當(dāng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)所有試?guó)喺菇常陂g自由飲水。第2天早上對(duì)所有試?guó)喅犰o脈采血10 mL，放置于經(jīng)抗凝處理的采血管中，4℃3 000 r/min離心10 min制備血漿，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。然后用半自?dòng)生化分析儀(TECHBICON RA-1000型)測(cè)定血清生化指標(biāo):葡萄糖(glucose，Glu)用 Glu Assay Kit的 GOD-PAP酶學(xué)分析法測(cè)定;TG用TG Kit的酶比色法(GPO-PAP法)測(cè)定;總膽固醇(cholesterol，CHO)用 CHO Kit的酶比色法(COD-PAP法)測(cè)定;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate pyruvate transaminase，GPT)用 GPT Kit的速率法測(cè)定;谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamate oxaloacetate transaminase，GOT)用 GOT Kit的速率法測(cè)定;γ -谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase，GGT)用GGT Kit的連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定。試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公司提供。

1.3.3 肝臟組織學(xué)檢測(cè)

從各組中隨機(jī)選取2只北京鴨，取肝后迅速于肝最大葉距邊緣8 mm處切取小塊肝組織，于10%的福爾馬林固定24 h，經(jīng)浸洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等步驟制作組織切片，切片厚度為6 μm，顯微鏡下觀察組織學(xué)特點(diǎn)并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.0中One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間平均值的比較采用Duncan氏多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

采用直線折線模型對(duì)填鴨的最佳填飼量進(jìn)行估算，直線折線模型［4］如下:

其中，Y為生長(zhǎng)性能(平均日增重、料重比)，X為試驗(yàn)飼糧中對(duì)應(yīng)的填飼量(g/d)，R為最佳填飼量(g/d)，L為當(dāng)達(dá)到最佳填飼量時(shí)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)效應(yīng)，U為模型的斜率。

表2 每只北京鴨每天填飼量Table 2 Daily force-feeding amount for each Pekin duck g

2 結(jié)果與分析

2.1 不同填飼量對(duì)北京鴨生長(zhǎng)性能的影響

由表 3可知，各組始重在(2 522.58±29.21)g和(2 559.25 ±50.43)g 之間，差異不顯著(P＞0.05)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，經(jīng)差減法得出對(duì)照組自由采食量為(259.55±18.59)g/d。除 300 g/d填飼組外，其他填飼組北京鴨末重和平均日增重顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。末重和平均日增重隨填飼量水平的提高而逐漸提高，當(dāng)填飼量為420 g/d時(shí)，平均日增重比對(duì)照組提高了47.86%，填飼量繼續(xù)增大，末重和平均日增重基本保持穩(wěn)定。填飼組料重比與對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

以平均日增重為評(píng)定指標(biāo)，建立直線折線模型估計(jì)填鴨的最佳填飼量，結(jié)果如下:

以上模型可以看出，填鴨的最佳填飼量為414.2 g/d，當(dāng)填飼量大于 414.2 g/d 時(shí)，填鴨的平均日增重基本趨于穩(wěn)定。

表3 不同填飼量對(duì)北京鴨生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effects of different force-feeding amounts on growth performance of Pekin ducks

2.2 不同填飼量對(duì)北京鴨血清生化指標(biāo)的影響

2.2.1 對(duì)血清Glu、TG和CHO 的影響

由表4可知，不同填飼量對(duì)北京鴨血清中Glu濃度的影響各組之間差異不顯著(P＞0.05)，這說(shuō)明北京鴨在不同填飼量下，血清中Glu濃度經(jīng)過(guò)隔夜禁食后能夠恢復(fù)到自由采食的狀態(tài)。不同填飼量顯著提高血清TG和CHO的濃度(P＜0.05)，隨填飼水平的升高，血清中TG和CHO濃度逐漸升高。在填飼量為 300、330、360、390、420 g/d時(shí)，血清中TG濃度沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，在填飼量為450 g/d時(shí)，TG濃度達(dá)到最大，顯著高于其他各組(P＜0.05)。當(dāng)填飼量為480 g/d時(shí)，血清CHO濃度達(dá)到最大，顯著高于其他各組(P＜0.05)，且與對(duì)照組相比，提高了77.4%。

表4 不同填飼量對(duì)北京鴨血清Glu、TG和CHO濃度的影響Table 4 Effects of different force-feeding amounts on serum Glu，TG and CHO concentration of Pekin ducks mmol/L

2.2.2 對(duì)血清GPT、GOT和GGT的影響

由表5可知，血清GPT活性隨填飼量的升高而逐漸升高，當(dāng)填飼量大于360 g/d時(shí)，GPT活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。而填飼對(duì)血清GOT和GGT活性影響不大，除450 g/d填飼組血清GGT活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)外，其他填飼組與對(duì)照組差異均不顯著(P＞0.05)。

表5 不同填飼量對(duì)北京鴨血清GPT、GOT和GGT活性的影響Table 5 Effects of different force-feeding amounts on serum GPT，GOT and GGT activity of Pekin ducks U/L

2.3 不同填飼量對(duì)北京鴨肝臟組織學(xué)的影響

填鴨屠宰后分離肝臟，觀察肝臟的外觀和組織結(jié)構(gòu)。對(duì)照組北京鴨肝臟呈紅褐色，表面光滑，切面無(wú)油脂滲出。而420、450和480 g/d填飼組北京鴨大部分肝臟腫大，表面色澤呈灰黃色，部分肝臟變硬，切面有油脂滲出。分別對(duì)8組試?guó)嗊M(jìn)行肝臟蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察其肝臟脂肪的沉積情況(圖1)。對(duì)照組肝臟呈現(xiàn)規(guī)則的肝細(xì)胞形態(tài)，肝細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)中有部分脂滴，但數(shù)量較少，不影響肝細(xì)胞的大小和形態(tài)(圖1-A)。填飼量為360 g/d時(shí)，肝細(xì)胞脂肪沉積情況與對(duì)照組相比，變化不明顯(圖1-B)。當(dāng)填飼量達(dá)到390 g/d時(shí)，肝臟脂肪沉積量有明顯的不同，脂肪組織增多，能清楚辨認(rèn)完整的肝細(xì)胞(圖1-C)。填飼量進(jìn)一步提高到420 g/d時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的油滴，且有部分油滴融合成了油囊，肝臟細(xì)胞脹大變型，但肝細(xì)胞完整(圖1-D)。450和480 g/d填飼組脂肪沉積差異不明顯，共同特點(diǎn)是脂肪空泡明顯增多，有的脂肪滴連成一片，將細(xì)胞核擠壓到一側(cè)，但并未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損。

圖1 北京鴨肝臟組織學(xué)切片圖Fig.1 Histological slices of liver tissue of Pekin ducks

3 討論

3.1 不同填飼量對(duì)北京鴨生長(zhǎng)性能的影響

在水禽生產(chǎn)上，填飼的主要目的是快速沉積脂肪以及生產(chǎn)肥肝，關(guān)于填飼對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響已經(jīng)有了比較深入的研究。許多研究表明，對(duì)水禽進(jìn)行填飼后，其生長(zhǎng)性能有了很大的提高［5-6］。本試驗(yàn)中，除300 g/d填飼組外，其他填飼組北京鴨試驗(yàn)?zāi)┲睾推骄赵鲋鼐@著高于對(duì)照組(P＜0.05)，420 g/d填飼組與對(duì)照組相比，平均日增重提高了47.86%，以上結(jié)果說(shuō)明填飼能夠提高北京鴨生長(zhǎng)性能，這與Zanusso等［7］在番鴨上和Chartrin等［8-9］在騾鴨上的研究結(jié)果一致。北京鴨沉積脂肪主要通過(guò)2個(gè)途徑:一是飼糧中的碳水化合物在糖酵解過(guò)程生成大量的脂肪酸，脂肪酸經(jīng)酯化生成TG存儲(chǔ)在體內(nèi);二是飼糧中的脂肪進(jìn)入消化道后，被腸上皮細(xì)胞內(nèi)的脂肪分解酶分解為甘油和脂肪酸后進(jìn)入血液，進(jìn)一步生成TG。而本試驗(yàn)中填鴨主要通過(guò)第1個(gè)途徑沉積脂肪，填飼造成脂肪酸合成代謝大于分解代謝，從頭合成的TG就會(huì)儲(chǔ)存在肝臟和脂肪組織中［10-12］。另一方面，填飼大量碳水化合物飼糧對(duì)北京鴨機(jī)體刺激增強(qiáng)，從而引起消化系統(tǒng)發(fā)育加速，有利于為機(jī)體發(fā)育輸送更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這也是填鴨增重的原因［13］。

本試驗(yàn)中，當(dāng)填飼量從420 g/d增加到480 g/d時(shí)，末重和平均日增重基本保持穩(wěn)定，再結(jié)合試驗(yàn)期間觀察420 g/d到480 g/d填飼組北京鴨排泄物的情況，發(fā)現(xiàn)有大量黃色玉米顆粒未能充分消化而直接排出體外，說(shuō)明填飼量達(dá)到某一值時(shí)，北京鴨已不能繼續(xù)充分消化飼料中更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而只能使體重保持穩(wěn)定。李琨瑛等［2］研究也表明，北京鴨填飼后胰淀粉酶的活性增長(zhǎng)與飼料量的增加不成比例，有部分淀粉未能充分消化。一般來(lái)說(shuō)，飼喂食物越多，腸道與食物接觸面積越小，必然會(huì)造成食物消化率低［14］。Tafaj等［15］也曾研究報(bào)道，奶牛和綿羊的飼喂量是自由采食的3倍時(shí)，2種動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率都降低，體重增加不明顯。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，北京鴨體重和平均日增重隨填飼量的增加而逐漸增加，當(dāng)填飼量繼續(xù)增大時(shí)體重保持穩(wěn)定，該結(jié)果與上述研究一致。

目前直線折線模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物氨基酸和維生素需要量的估算上。Luo等［16］和Yuan等［17］在水產(chǎn)上也應(yīng)用直線折線模型來(lái)確定魚(yú)類(lèi)飼喂量的研究報(bào)道，但還沒(méi)有相關(guān)填鴨填飼量的研究報(bào)道。本試驗(yàn)中，以填鴨平均日增重為評(píng)定指標(biāo)，建立直線折線模型估算填鴨的最適填飼量為414.2 g/d，與本試驗(yàn)平均日增重結(jié)果較好的420 g/d相似，可為填鴨生產(chǎn)提供更好的技術(shù)方法。

3.2 不同填飼量對(duì)北京鴨血清生化指標(biāo)的影響

血糖在動(dòng)物機(jī)體的能量代謝中起著重要的作用，它是維持機(jī)體穩(wěn)定的首要物質(zhì)，而水禽肝臟又是調(diào)節(jié)血糖平衡的主要器官［18］。家禽脂肪發(fā)育和脂肪沉積的程度主要取決于血清中TG和CHO水平［19］，而血清中的脂質(zhì)主要來(lái)源于肝臟和飼糧。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，不同填飼量對(duì)填鴨血清中Glu濃度沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，顯著影響血清TG和CHO濃度(P＜0.05)。在填飼量為300、330、360、390、420 g/d 時(shí)，血清中 TG 濃度沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，在填飼量為450 g/d時(shí)，TG濃度達(dá)到最大;而在填飼量為480 g/d時(shí)，CHO濃度達(dá)到最大，與對(duì)照組相比提高了77.4%。這說(shuō)明當(dāng)飼糧中的碳水化合物經(jīng)北京鴨腸道消化進(jìn)入血液后，大部分會(huì)被肝臟攝取用于脂肪的合成［20］，最終導(dǎo)致血清中TG和CHO濃度升高，而Glu濃度沒(méi)有變化。有研究表明，北京鴨被填飼或注射Glu以后，其糖耐量變大，但血糖最終在110 min內(nèi)恢復(fù)到正常水平［21］。過(guò)量的脂肪進(jìn)入肝臟會(huì)使脂肪以極低密度脂蛋白(VLDL)的形式運(yùn)輸?shù)酵鈬窘M織和肌肉中，當(dāng)脂肪含量進(jìn)一步增加時(shí)，誘發(fā)脂肪肝的形成，血清中TG和CHO濃度也隨之增加［22］。Armstrong 等［23］和 van den Brand 等［24］給母豬飼喂不同能量水平的飼糧，母豬空腹后血清中Glu濃度沒(méi)有任何變化。Davail等［25］研究也表明，對(duì)番鴨、騾鴨和北京鴨填飼后，血清中的TG和CHO濃度急速升高，Glu濃度卻是先升高再降低，而后基本保持穩(wěn)定，Glu濃度沒(méi)有TG和CHO濃度變化明顯，這與李翔［26］在朗德鵝上和 Molee等［27］在騾鴨上的研究結(jié)果一致。

肝臟是機(jī)體內(nèi)含酶最豐富的器官，肝臟受損時(shí)，會(huì)發(fā)生肝細(xì)胞通透性增加和細(xì)胞壞死等癥狀，致使血清酶量發(fā)生變化，因此，血清酶檢查是評(píng)估肝細(xì)胞損傷的重要途徑。當(dāng)肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞通透性增高及線粒體損傷時(shí)，GPT、GOT活性增高，并且GPT、GOT活性的高低變化與肝細(xì)胞受損的程度相一致。血清中GGT含量很少，主要來(lái)自肝臟，當(dāng)動(dòng)物發(fā)生病毒性肝炎、肝硬化和肝臟腫瘤等疾病時(shí)，血清GGT才有不同程度升高。而GOT與GPT活性的比值(GOT/GPT值)有助于估計(jì)患者肝細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度和肝臟疾病的鑒別［28］。慢性肝炎時(shí)GOT/GPT值小于1，肝細(xì)胞嚴(yán)重受損時(shí)GOT/GPT值大于1，并且隨著病情發(fā)展，GPT活性逐漸增大［29］。本試驗(yàn)中，GOT/GPT值小于1，并且GPT隨填飼量增加而逐漸增加，差異顯著。這說(shuō)明填飼導(dǎo)致北京鴨發(fā)生慢性肝炎，但肝細(xì)胞是否受到嚴(yán)重?fù)p傷還需從肝臟切片觀察進(jìn)一步驗(yàn)證。Babilé等［30］也研究表明，填鴨的肝臟并未發(fā)生壞死，填飼停止后肝臟可以恢復(fù)到正常狀態(tài)。本試驗(yàn)也驗(yàn)證了Davail等［25］的研究結(jié)果，北京鴨比番鴨、騾鴨肥肝易感性弱，肝臟變性和壞死的比率較小，這可能與北京鴨脂蛋白酯酶(LPL)活性維持在一定的水平，而番鴨與騾鴨填飼后LPL活性顯著降低有關(guān)，這說(shuō)明與騾鴨和番鴨相比，北京鴨肝臟可能具有相對(duì)較強(qiáng)的脂質(zhì)分泌功能。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，填飼組北京鴨血清中TG、CHO濃度和GPT活性顯著高于對(duì)照組，與Fournier等［11］和蘇勝?gòu)┑龋?1］研究結(jié)果一致。

3.3 填鴨肝臟組織學(xué)觀察

肝臟中合成的TG主要通過(guò)VLDL和高密度脂蛋白(HDL)運(yùn)送，當(dāng)肝臟合成TG的速度高于VLDL和HDL的分泌速度和脂肪酸β氧化速度時(shí)，造成肝臟中TG的大量沉積，形成肥肝。本試驗(yàn)中，隨著填飼量的升高，北京鴨肝臟組織中脂肪沉積量逐漸增加，在填飼量在420 g/d以上時(shí)，肝細(xì)胞充滿(mǎn)大小不等的脂滴，部分小脂滴融合成大脂滴，有的甚至連成一片，肝細(xì)胞雖急劇增大，但結(jié)構(gòu)仍保持完整，組織中沒(méi)有壞死和破裂的現(xiàn)象，與蘇勝?gòu)┑龋?1］和朱麗慧等［32］在朗德鵝上肝細(xì)胞變化趨勢(shì)一致，同時(shí)也驗(yàn)證了上述肝細(xì)胞未受到嚴(yán)重?fù)p傷的結(jié)論。而瞿浩等［33］研究還發(fā)現(xiàn)，肝臟除了脂肪滴的沉積和肝細(xì)胞體積的增大之外，還包含細(xì)胞數(shù)量的增多。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟細(xì)胞數(shù)量并未增多。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)條件下，與對(duì)照組相比，填飼能顯著提高北京鴨平均日增重。當(dāng)繼續(xù)提高填飼量至420 g/d以上時(shí)，末重和平均日增重基本保持穩(wěn)定。用平均日增重建立直線折線模型估算填鴨的最佳填飼量為414.2 g/d，與本試驗(yàn)平均日增重結(jié)果較好的420 g/d相近。

②填飼能明顯提高北京鴨血清中TG、CHO濃度和GPT活性，造成肝臟細(xì)胞沉積大量脂肪，發(fā)生慢性炎癥，但肝細(xì)胞未受到嚴(yán)重?fù)p傷。

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